【摘 要】
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目的:本研究旨在探讨RSK4通过调节PI3K/Akt信号通路逆转乳腺癌阿霉素耐药的作用及分子机制。方法:1.利用KM plotter和ROC Plotter在线工具分析RSK4表达水平与乳腺癌总生存率的相关性以及对阿霉素疗效的影响。2.选取乳腺癌MCF-7细胞为研究对象,采用DOX浓度递增法,构建乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/DOX,应用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和蛋白质免疫印迹法
【基金项目】
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项目名称:RSK4靶向PI3K/Akt通路调控ACTN4在乳腺癌化疗耐药中的机制研究,项目合同编号:81860464,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2019年01月01日-2022年12月31日
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目的:本研究旨在探讨RSK4通过调节PI3K/Akt信号通路逆转乳腺癌阿霉素耐药的作用及分子机制。方法:1.利用KM plotter和ROC Plotter在线工具分析RSK4表达水平与乳腺癌总生存率的相关性以及对阿霉素疗效的影响。2.选取乳腺癌MCF-7细胞为研究对象,采用DOX浓度递增法,构建乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/DOX,应用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Western blot）分别检测这两株细胞中RSK4的表达情况。3.通过病毒包装转染的方法构建RSK4稳定过表达的乳腺癌耐药细胞株,将细胞分为三组:转染过表达RSK4慢病毒载体的细胞MCF-7/DOX/RSK4为实验组,转染空白病毒载体的细胞MCF-7/DOX/NC为阴性对照组,未转染的细胞MCF-7/DOX为空白对照组。4.采用CCK-8方法检测各组细胞增殖能力和IC50变化;通过细胞划痕及Transwell侵袭实验检测各组细胞迁移和侵袭能力的变化;通过流式细胞术检测RSK4过表达对乳腺癌耐药细胞株凋亡的影响。5.采用Western blot检测各组细胞中耐药相关蛋白（ABCG2、ABCB1、MRP2）,凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Caspase3）和PI3K/Akt信号通路核心蛋白表达的变化情况,来初步探讨RSK4参与人乳腺癌细胞对阿霉素耐药过程的可能机制。6.利用MCF-7/DOX和MCF-7/DOX/RSK4细胞构建裸鼠皮下耐药移植瘤模型,实验分为4组:MCF-7/DOX组、MCF-7/DOX+DOX治疗组、MCF-7/DOX/RSK4组、MCF-7/DOX/RSK4+DOX治疗组,每组4只。观察对比每组裸鼠瘤体生长速度、大小和体积。结果:1.RSK4表达高的乳腺癌患者总生存率显著高于低表达患者（P<0.05）;当乳腺癌患者应用蒽环类药物治疗后,RSK4高表达患者的治疗效果优于低表达组（P<0.05）。2.RSK4在耐药乳腺癌细胞MCF-7/DOX中较亲本乳腺癌细胞MCF-7中表达量显著下降（P<0.05）。3.成功构建了RSK4过表达的人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DOX,q RT-PCR和Western blot实验检测转染效果,结果显示实验组的细胞中RSK4基因的m RNA及蛋白表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组（P<0.05）。4.CCK-8检测各组细胞IC50值的实验结果显示,MCF-7/DOX组的IC50值较MCF-7细胞显著升高（P<0.05）;过表达RSK4后,MCF-7/DOX/RSK4组与阴性对照组和空白组细胞相比,IC50值明显下降（P<0.05）。5.CCK-8增殖实验结果显示,MCF-7/DOX细胞增殖活力较MCF-7细胞明显增加（P<0.05）;实验组MCF-7/DOX/RSK4细胞增殖显著低于空白组和阴性对照组（P<0.05）;细胞划痕实验和Transwell侵袭实验结果表明实验组MCF-7/DOX/RSK4细胞的迁移和侵袭能力均显著低于空白组和阴性对照组（P<0.05）;流式细胞术结果显示实验组细胞凋亡率显著高于空白组和阴性对照组（P<0.05）。6.Western blot实验结果表明:与空白组和阴性对照组相比,实验组中的抗凋亡相关蛋白Bcl-2和Caspase3表达水平显著下降（P<0.05）,Bax蛋白水平明显升高（P<0.05）;实验组中耐药相关蛋白BRCP、p-gp、MRP2和PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt的表达水平均较空白组和阴性对照组显著下降（P<0.05）。7.在裸鼠皮下耐药移植瘤模型中,RSK4过表达组的裸鼠移植瘤体积与生长速度明显小于对照组（P<0.05）;使用阿霉素治疗后,RSK4过表达组的裸鼠体积和生长速度较未治疗组显著减小（P<0.05）。结论:1.RSK4与乳腺癌的预后及治疗有关,其表达越高,预后越好,化疗应答疗效越好。2.RSK4在乳腺癌阿霉素耐药诱导过程中表达降低,过表达RSK4抑制乳腺癌耐药细胞的增殖、迁移和侵袭,增加细胞凋亡,并抑制乳腺癌耐药移植瘤的生长。3.RSK4参与了乳腺癌细胞对阿霉素耐药性的调节,其作用机制很可能与PI3K/Akt信号通路有关。
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