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目的:
本实验通过聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(polymerasechain reaction-restriction fragment length polymorphism PCR-RFLP)分析方法,检测中国华南地区汉族过敏性紫癜(Henoch-Schonlein Purpura HSP)儿童血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)-634G/C基因多态性,其中包括紫癜性肾炎(Henoch-Schonlein Purpura.nephritis HSPN)患者及非HSPN患者,从而探讨VEGF-634G/C与儿童HSP尤其是HSPN易感性的关系,从基因水平预测HSP的遗传易感因素,为揭示HSP的病理生理学和遗传学机制提供理论依据。
方法:
1、实验对象:包括HSP患儿病例组(100例)和健康对照组(50例),其中病例组包括HSPN组(50例)和非HSPN组(50例)。
2、实验标本的留取:各组实验对象入选时采2%乙二胺乙酸(EDTA)抗凝血2-3ml,分离出血浆和血细胞后分别贮存于-80℃保存备用。
3、血细胞基因组DNA的提取:按照全血基因组DNA提取试剂盒提取各组外周血基因组DNA,紫外分光光度法测定DNA的浓度和纯度。
4、VEGF-634G/C基因多态性分析:应用PCR/RFLP法检测,以外周血基因组DNA为模板进行PCR扩增,PCR上下游引物序列参照参考文献及基因库资料设计。PCR反应产物用限制性内切酶酶切,酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离,紫外灯下判断结果。
5、血浆VEGF水平检测:各组实验对象血浆用EIJSA双抗夹心法检测VEGF水平。
6、统计学处理:
所有数据用SPSS11.5处理。计算出各组实验对象VEGF基因型频率和等位基因频率,然后经Hardy-Weinburg遗传平衡定律检验,检验各基因型频率是否已达遗传平衡,具有群体代表性。各组问构成比差异采用x<2>检验。计量资料用x±s表示,各组间数据的比较依据资料的性质,用多个样本均数间的多重比较方差分析。
结果:
1、各组实验对象的年龄、性别构成比无显著差别,具有可比性。
2、所选实验对象VEGF基因型频率和等位基因频率经Hardy-Weinburg遗传平衡定律检验,检验各基因型频率已达遗传平衡,具有群体代表性。
3、HSPN组CC基因型频率32.0%,显著高于健康对照组CC基因型频率10.0%,差异有统计学意义(P<0.05);HSPN组C等位基因频率56.0%,显著高于健康对照组C等位基因频率35.0%,差异有统计学意义(P<0.05);而CC基因型和C等位基因在无HSPN的HSP组和健康对照组间的分布无显著差异性。
4、与GG基因型相比,CC基因型的HSP患儿HSPN的发生率明显上升(P<0.05)。
5、HSPN组VEGF (189.55±56.23ng/L)较健康对照组VEGF(110.40±30.11ng/L)明显升高(P<0.05)。
6、CC基因型者血浆中VEGF水平明显增加(P<0.05)。
结论:
1、VEGF-634G/C基因多态性与HSPN发生有关,C等位基因可能是HSPN的易感基因。
2、HSPN患者血浆中VEGF水平明显升高。
3、血浆中的VEGF与VEGF-634G/C基因多态性可能相关,CC基因型者血浆中的VEGF水平明显上升。