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人脑胶质细胞瘤是中枢神经系统(central nervous system, CNS)中最常见的肿瘤类型。其发病率约占颅内原发肿瘤的40%，其中有近80%为高度恶性肿瘤。脑胶质细胞瘤的预后差，5年存活率为20-30%，高级别恶性胶质瘤的平均存活期仅为9-12月。近年来，尽管胶质瘤的手术、放疗及化疗等技术有很大提高，但临床治疗效果并未显著改善。高级别恶性胶质瘤治疗困难的原因主要是其具有高度恶性生物学特征，包括：过度增殖、较强的侵袭和迁移能力等。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，在分子生物水平治疗胶质细胞瘤已成为国内外学者研究的重要方向。寻找关键的治疗恶性胶质瘤的分子靶点，从根本上改变其恶性生物学特性，对治疗这一疾病有着重要的科学意义和临床应用价值。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)及其酪氨酸激酶受体c-Met是影响脑肿瘤生长和血管发生的重要分子。HGF和c-Met在脑肿瘤中广泛表达，且表达水平与肿瘤的恶性程度、血管密度及患者预后密切相关。HGF和(或)c-Met在脑肿瘤细胞中过表达会促进肿瘤发生、生长以及肿瘤相关的血管生成。相反，在体内荷瘤实验中，通过下调HGF和c-Met的表达可以抑制移植肿瘤生长和瘤内血管生成。HGF主要由肿瘤细胞合成并分泌，而其所结合的受体c-Met则表达于肿瘤细胞和血管内皮细胞。c-Met激活后不但促进了肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移和侵袭，还抑制了肿瘤细胞凋亡。体内实验发现，肿瘤血管内皮细胞中c-Met激活后诱导了胞外基质降解、微管形成以及血管发生。HGF诱导脑肿瘤细胞血管发生的方式包括直接作用和间接作用两种：间接作用为HGF通过调控某些与血管发生相关的蛋白来发挥作用；目前对于直接作用的分子机制还不明确。鉴于HGF/c-Met信号通路在脑肿瘤发生发展中的重要作用，通过阻断该通路达到抑制脑肿瘤生长和血管发生，已成为近年来人脑胶质瘤分子靶向治疗的重要研究方向。Ulrike Stein等于2009年利用全基因组表达分析技术首次在人结肠癌组织标本发现了结肠癌转移相关分子1(metastasis-associated in colon cancer1,MACC1)。该研究发现，在结肠癌细胞中MACC1与c-Met的启动子结合，调节了c-Met基因的表达和活化，决定性的影响了c-Met所参与的信号传递，最终通过调控HGF/c-Met信号通路促进细胞增殖、侵袭和迁移。随后多项研究证实，MACC1在肝癌、肺癌、卵巢癌的发生、侵袭及转移过程中均发挥重要作用。关于MACC1与脑胶质瘤病理分级的相关性；其在脑肿瘤组织中的表达和细胞内定位情况；对胶质瘤的恶性生物学特性的影响；在胶质瘤细胞中与HGF的受体c-Met及其所调控的下游信号分子间的关系。目前国外尚未有相关报道，本课题基于以上问题进行了系列研究，结论如下：1检测MACC1基因在人脑胶质瘤中的表达情况本研究首先采用RT-PCR和Western blot方法检测了四株人恶性胶质瘤细胞系(U251、U87、SHG44、BT325)中MACC1mRNA和蛋白的表达水平。实验结果发现，MACC1mRNA和蛋白在四株细胞系中均有表达，且在U87细胞中的表达量相对较高。这提示MACC1在人恶性胶质瘤细胞细胞系中的普遍高表达可能与胶质瘤细胞的恶性生物学特性相关。同时，也为后续RNAi实验中细胞系的选择提供了依据。接着利用realtime-PCR和免疫组化染色方法检测了MACC1mRNA和蛋白在98例不同临床病理级别的人脑胶质细胞瘤标本中的表达情况。实验结果发现，MACC1分子定位于胶质瘤细胞的胞核与胞浆；MACC1mRNA和蛋白在各病理分级的胶质细胞瘤组织中广泛表达，且表达量随病理级别的升高而增高。这提示MACC1在人脑胶质瘤的发生和恶性演化过程中具有重要功能。最后运用免疫组化染色方法观察了上述脑胶质细胞瘤组织中的c-Met的细胞定位和表达情况。结果显示，c-Met在脑胶质瘤细胞中定位于胞浆和胞膜；表达量随病理级别升高而增高，且与MACC1的表达高度正相关。这提示，与结肠癌细胞中MACC1发挥作用方式相同，MACC1在胶质瘤细胞中可能是通过调控c-Met的表达间接影响肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭的恶性生物学行为的。2构建MACC1基因RNAi慢病毒载体及稳定转染细胞系本研究以MACC1表达水平较高的人脑胶质瘤细胞系U87为研究对象，设计合成了特异性RNAi片段，并将其克隆入pLKO.1载体，构建了经测序正确的MACC1基因RNAi慢病毒载体pLKO.1-MACC1shRNA-1和pLKO.1-MACC1shRNA-2。通过慢病毒包装，感染目的细胞，嘌呤霉素筛选，建立了稳定转染的细胞系U87-S1（MACC1shRNA-1）、U87-S2（MACC1shRNA-2）和U87-NC（阴性对照组）。经RT-PCR与Western blot验证U87-S1和U87-S2两组细胞的MACC1mRNA和蛋白的表达明显下调。最终成功获得了能够稳定下调MACC1基因表达的胶质瘤细胞系。这为MACC1基因在胶质瘤细胞中的生物学功能及分子作用机制的后续研究奠定了实验基础。3观察MACC1基因干涉后胶质瘤细胞生物学行为改变本部分实验以U87、U87-NC、U87-S1和U87-S2四组细胞为研究对象。体外实验中，首先通过MTT实验绘制细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测细胞克隆形成数量的实验方法，观察了MACC1基因对胶质瘤细胞增殖和周期的影响。结果显示，与其它两组相比，生长明显减缓增殖数明显降低；G1期细胞明显增多，S期细胞显著减少，出现G0/G1期阻滞；U87-S1和U87-S2组的克隆形成数量明显低于对照组。研究表明，MACC1基因表达下调后明显抑制了胶质瘤细胞的增殖。进一步运用细胞划痕实验和Transwell侵袭小室方法研究了MACC1基因对胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响。实验结果发现，U87-S1和U87-S2组细胞的迁移能力与对照组相比明显减弱； U87-S1和U87-S2组细胞穿过基质胶的数量也明显低于其它两组。研究证明，MACC1基因RNAi对胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力具有明显的抑制作用。在体内研究中，采用裸鼠荷瘤实验研究了MACC1基因RNAi对胶质瘤细胞体内成瘤性、增殖和侵袭能力的影响。将U87、U87-NC、U87-S1和U87-S2各组细胞分别接种于裸鼠皮下，定期测量肿瘤体积，观察28天后处死。结果显示，U87干涉组细胞在裸鼠体内的成瘤能力和肿瘤生长速度与对照组相比明显降低；移植瘤体积和重量与对照组相比也明显减少。裸鼠荷瘤实验进一步验证了，MACC1基因表达下调后抑制了胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。4初步探讨MACC1影响胶质瘤细胞生物学行为的分子机制本实验以U87、U87-NC、U87-S1和U87-S2为研究对象，利用western blot方法观察了c-Met的表达情况；检测了与胶质瘤细胞增殖和侵袭密切相关的，由MAPK/ERK信号通路主要调控的几个下游分子的表达情况。结果显示，U87细胞中MACC1基因下调后，p27表达量显著升高；c-Met、cdk2以及MMP2的表达量明显减少。这提示，MACC1可能是通过调控c-Met的表达来调节HGF/c-Met信号通路，继而影响了其下游MAPK/ERK信号途径，从而间接的影响了与细胞增殖和侵袭密切相关的p27、cdk2和MMP2等下游分子，最终参与了胶质瘤的发生、生长和恶性演化的过程。上述研究结果，为MACC1成为脑胶质瘤恶性程度判断的生物标志物提供了理论依据；同时，也为脑胶质瘤基因治疗提供了一个潜在分子靶点。