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研究背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是由自身免疫耐受失衡引起的系统性自身免疫性疾病,其病理特征为进行性、持续性的滑膜炎及新生血管翳的形成,继而引起软骨和骨的破坏及侵蚀,甚至关节畸形,导致关节功能丧失。RA的确切病因及发病机制迄今不明,目前认为与环境、感染、遗传等因素密切相关。外来抗原可能是RA发病的主要诱因,抗原经过抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)的吞噬、加工、处理后,将抗原信息传递给并激活T淋巴细胞,同时促进滑膜增生、诱导滑膜炎症。已有研究证实,RA所涉及的自身抗原主要是与MHC(major histocompatibility complex)Ⅱ类分子相关的热休克蛋白(heat shock protein, HSP)、Ⅱ型胶原蛋白(type Ⅱ collagen, CⅡ)等。CⅡ是关节软骨基质的主要有机成分,有学者证实HLA(human leukocyte antigen)-DRl和DR4均可与CⅡ发生特异性结合,其作为一种自身抗原在RA发病机制中有非常重要的作用。与此同时,T细胞亚群功能紊乱与炎症因子的持续存在被认为是诱导并维持RA的关键因素,RA患者及动物模型的滑膜组织中有大量CD4+T细胞浸润,其产生的细胞因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和白细胞介素(interleukin,IL)-17A等也增多,辅助性T(T helper,Th)淋巴细胞的异常活化在RA发病中处于中心环节。Th17细胞主要分泌IL-17A、EL-2、IL-22、IL-6、TNF-α等促炎症因子。研究表明IL-17A可以和TNF-α、IL-1β干扰素(interferon,IFN)-γ等相互作用产生协同效应,具有强大促炎效应,能够通过多种途径参与RA关节的慢性炎症和进行性损害。IL-17A能诱导滑膜细胞产生基质金属蛋白酶,抑制软骨基质的形成,且能诱导成骨细胞表达核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL)促进骨侵蚀；过表达的IL-17A能够上调RANKL及其受体的表达,破坏RANKL/OPG的平衡而加重骨破坏。调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)是一群表型为CD4+CD25+Foxp3+的T细胞,具有免疫应答负调节和免疫无反应性两大功能,可以通过直接接触抑制和分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β来抑制活化的效应T细胞。关于Treg细胞在RA患者及动物模型的研究表明,其在RA发病中起重要作用,并与疾病活动度及药物干预等因素相关。用抗CD25抗体干预胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)小鼠后,其病情明显加重,缺乏Treg细胞的小鼠早期即可出现严重的侵蚀性关节炎。Treg和Th17细胞在功能上相互拮抗,二者之间的平衡在RA的发生、发展中扮演了重要角色。Treg和Th17细胞都可由初始T细胞(naive CD4+T cells,Th0)分化产生,TGF-β和IL-6在Treg和Th17细胞分化平衡中起重要的调控作用,所涉及的细胞因子网络以及信号通路尚不明确,其能否作为RA治疗的靶点仍需进一步探讨。综上所述,深入探讨在RA发病中Treg和Th17细胞定位及功能特征,进一步研究CⅡ抗原暴露、Treg/Th17免疫失衡与骨破坏之间的关系,从而明确其在RA发生发展中的作用,对揭示疾病的发病机制、药物靶标和判断病情具有重要意义。乌梢蛇(Zaocys)治疗RA始载于宋代《开宝本草》,其“主顽痹诸风”,性甘平,归肝经,具有祛风、通络、止痉之功效,在中国用于治疗RA已经有1000多年的历史。现代药理学研究表明其具有抗炎、镇痛作用,但其有效成分及作用靶点不明确。我们课题组前期研究表明,乌梢蛇总蛋白可以抑制RA滑膜细胞增殖,诱导其凋亡,并且能抑制成纤维样滑膜细胞炎性细胞因子分泌。对乌梢蛇总蛋白初步分析后发现其含有大量CⅡ,进一步研究证实,乌梢蛇Ⅱ型胶原蛋白(ZCⅡ)能够改善佐剂性关节炎大鼠的关节肿胀,抑制滑膜细胞炎症因子的水平和活性。目前,关于ZCⅡ在乌梢蛇有效成分中的分析及其有效肽段的研究还处于初步探索阶段,在药物剂型的改进、药效的提高和药理作用机制等方面还需进一步深入研究。综上所述,Treg和Th17细胞的分化失衡可能在RA的发生、发展中扮演了重要角色,Treg/Th17失衡所涉及的免疫活化部位、细胞因子网络以及信号通路尚不明确,ZCⅡ治疗RA的疗效及其作用机制还有待深入研究。因此,进一步探索Treg/Ti17失衡及其细胞因子在CIA小鼠体内不同部位的表达,深入研究ZCⅡ治疗RA的作用机制,以进一步明确RA的免疫学发病机制及探索在此环节上进行干预治疗的意义,为临床RA的干预治疗提供新思路。目的1分析乌梢蛇CⅡ的同源性2研究乌梢蛇CⅡ对CIA小鼠Treg/Th17平衡的影响。方法1乌梢蛇CⅡ的同源性分析1.1胃蛋白酶降解法提取乌梢蛇CⅡ乌梢蛇处死后磨成粉,溶于盐酸胍-Tris-HCl溶液中除去蛋白多糖。乙酸溶液重悬,70%甲酸调节溶液PH值至2.8。沉淀与胃蛋白酶消化液混悬。取上清后缓慢加入5mol/LNaCl,盐析沉淀。获得胶原蛋白沉淀,乙酸溶解,除去不溶物质。将粗提蛋白用Na2HPO4透析液4℃透析过夜。TBS溶解沉淀,透析过夜。滤膜过滤,DE-52离子交换柱经Tris-HCl/NaCI透析液平衡,装入交换柱内。在核酸蛋白检测仪下,自动部分收集仪收集第1峰,经乙酸重新溶解,充分透析去盐纯化,冻干,4℃保存。1.2乌梢蛇CⅡ同源性测定1)SDS-PAGE凝胶电泳法测定分子量：将提取的乌梢蛇CⅡ、鸡CⅡ及蛋白分子量标准(44KD～200KD)进行SDS-PAGE凝胶电泳电泳,分离胶的浓度为10%,浓缩胶浓度为5%,电泳条件：分离胶80V,浓缩胶120V,时间约3h。考马斯亮蓝染色,脱色、拍照。2)紫外分光光度计测定提取乌梢蛇CⅡ紫外吸收波：将提取的乌梢蛇CⅡ、鸡CⅡ等待测样品置入比色杯中,调节波长180nm-500nm范围进行扫描,纸速80mm/min,扫描速度200nm/min,测定乌梢蛇CⅡ,sigma标准鸡CⅡ紫外光谱吸收高峰。3)质谱检测分析乌梢蛇CⅡ的同源性：样品胶内酶解,使用ZipTip(?)C18纯化浓缩样品,点靶后进行质谱检测,获取肽质量指纹图谱,使用Mascot软件对质谱的PMF进行数据库检索比对,采用MS和MS/MS联合模式搜索Swissprot数据库,种属数据库为动物数据库,分子量范围为800-4000KD,必须有4个以上肽段匹配。取蛋白评分大于95%的为高度可信的鉴定结果。2乌梢蛇CⅡ对CIA小鼠Treg/Th17平衡的影响2.1CIA模型的诱导及评分将鸡CⅡ与CFA制成CⅡ乳剂,小鼠尾根部多点注射,免疫注射7d左右,重复加强免疫一次。正常组用冰醋酸同法注射。应用视觉评分法在免疫后第14、17、20、23、26、29天评价小鼠关节肿胀情况,评分标准：0分：无红肿；1分：趾关节红肿；2分：趾关节和足趾肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。得出关节指数((?)rthritic score, AS),每只小鼠所有病变关节分数的总和为AS,最高值为16分。2.2分组及给药方案将小鼠分为正常组(Normal control)、模型组(CIA model group)、ZCⅡ低剂量组(Low dose CⅡ group)(10μg·kg-1d-1)、ZCⅡ中剂量组(Medium dose CⅡ group)(20μg·kg-1d-1)、ZCⅡ高剂量组(High dose CⅡ group)(40μg·kg-1d-1);各干预组均以ZCⅡ连续灌胃给药一周(21-28天),正常组和CIA模型组以等量的溶媒灌胃。2.3关节组织病理学评分无菌取膝关节,4%甲醛固定,EDTA脱钙液脱钙,石蜡包埋、切片、HE染色,OLYMPUS光学显微镜观察滑膜病理组织学变化并摄片。由2名病理学专家共同评分,用0-4级表示滑膜病变程度,0级：正常；1级：关节组织有少量散在炎细胞浸润；2级：关节滑膜轻度增生,并伴有局灶性炎性细胞浸润；3级：滑膜增厚,排列疏松、紊乱,炎细胞大量浸润,新生血管明显增加,伴有少量关节软骨破坏,4级：滑膜增生明显,血管翳形成,关节软骨和骨组织被严重破坏。2.4脾脏、肠系膜淋巴结中淋巴细胞分离无菌取出脾脏及肠系膜淋巴结,制作成单细胞悬液,脾脏细胞悬液中加入适量红细胞裂解液,常规制备脾脏及肠系膜淋巴结的淋巴细胞悬液,用10%FBS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×106cell·mL-1。2.5Treg和Th17细胞比例测定采用流式细胞术分析脾细胞、肠系膜淋巴结淋巴细胞中Treg细胞和Th17细胞比例,简述如下：Treg细胞流式检测：流式染色缓冲液重悬细胞,加入Fc受体阻断剂,分别加入FITC anti-mouse CD4和APC anti-mouse CD25,4℃避光孵育；预冷流式染色缓冲液洗涤细胞,重悬细胞加入Fixation/Permeabilization工作液,4℃避光孵育；加入Permeabilization Buffer洗涤细胞,离心弃上清液；加入含Fc受体阻断剂的破膜缓冲液,保证100μl体系4℃孵育15min加入PE anti-mouse Foxp3抗体和PE RatIgG2a同型对照,4℃避光孵育30min;加入破膜工作液洗涤；加入流式染色缓冲液,上机检测分析。Th17细胞流式检测：分别加入500μl细胞悬液,然后加入PMA和BFA混匀,37℃、5%CO2培养箱培养4-6小时；收集细胞,流式染色缓冲液重悬细胞,加入表面抗体Anti-Mouse CD4FITC,4℃避光孵育30min加入FIX&PERM ReagentA室温孵育15min加入染色缓冲液,弃上清收集细胞；加入FIX&PERM ReagentB,并加入Anti-Mouse/Rat IL-17A PE(同型对照管加入同等剂量的抗体),室温孵育2Omin;加入染色缓冲液弃上清收集细胞；加入流式染色缓冲液,上机检测分析。膝关节组织中Treg/Th17细胞比例分析采用直接免疫荧光技术,简述如下：组织切片经过二甲苯脱蜡2次；依次经梯度浓度乙醇和纯水各1次,进行水化处理；PBS洗涤,煮沸后放置8min(柠檬酸抗原修复液),3%BSA封闭液封闭阻断非特异性结合位点；FITC-anti-CD4(1:100)/PE-anti-Foxp3(1:100)和FITC-anti-CD4(1:100)/PE-anti-IL-17A(1:100)分别标记Treg和Th17细胞,4℃孵育过夜；抗荧光淬灭剂封片,荧光显微镜观察Treg和Th17细胞的比例变化,并拍照。2.6脾细胞、MLNLs培养上清及外周血中TGF-β和IL-17A浓度检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附技术检测,简述如下：常规制MLNLs悬液1×106cell·ml-1,无菌的96孔培养板每孔加入LYM悬液和PMA,设3个复孔,置于37℃、5%CO2培养箱中培养48h,收集细胞培养上清,用于IL-17A活性检测；另培养8h的细胞,离心后弃上清,用PBS洗涤,重新加入无血清的DMEM培养液至原量,继续培养72h,收集细胞培养上清用于TGF-β活性的检测。3统计学分析：所有实验数据的测定值皆以均数±标准差(x±s)表示。关节炎评分差异采用双因素方差分析法比较,其他指标差异采用单因素方差分析法比较。方差齐性采用Levene法检验,组间两两比较采用LSD检验(方差齐)或Tamhane’s T2检验(方差不齐)进行。以双侧P<0.05为有统计学差异。结果1乌梢蛇CⅡ的同源性1.1SDS-PAGE电泳法测定提取的ZCⅡ分子量约为110KD～140KD,与Sigma鸡CⅡ标准品一致。1.2紫外分光光度计测定提取的ZCⅡ吸收峰为230nm左右,与Sigma鸡CⅡ标准品一致1.3质谱分析获取ZCⅡ肽质量指纹图谱,使用Mascot软件对质谱的PMF进行数据库检索比对,所得肽质量指纹图谱与其他物种有4个以上肽段匹配,蛋白评分大于95%,鉴定为ZCⅡ。2乌梢蛇CⅡ对CIA小鼠关节炎的影响小鼠在注射鸡CⅡ乳剂后于14、17、20、23、26、29天均有不同程度的炎症反应,表现为双侧后足爪肿胀及颜色变红。与模型组相比,ZCⅡ可减轻CIA小鼠足爪肿胀度,高、中、低剂量组间足爪肿胀改善有差异,差异均具有统计学意义(P<0.05)。病理组织学观察结果显示,正常小鼠滑膜组织排列规则,未见淋巴细胞、浆细胞的浸润,软骨及骨的破坏；与正常小鼠相比,模型组关节组织中滑膜细胞增生明显,呈乳头样或栅栏样突起；滑膜组织中有大量炎性细胞浸润,新生血管及血管内膜增厚；滑膜下层纤维组织增生,炎性细胞浸润及血管翳形成,软骨中可见大量炎性细胞浸润。ZCⅡ干预组可改善组织病理学变化,主要表现为抑制滑膜细胞增生,炎性细胞浸润减少,新生血管生成减少,软骨受损程度减轻,差异均具有统计学意义(P<0.05)。3乌梢蛇CⅡ对CIA小鼠Treg/Th17细胞的影响与正常组比较,CIA小鼠脾细胞及MLN淋巴细胞中Treg和Th17细胞的比率均上升。与CIA模型组比较,口服ZCⅡ上调CIA小鼠脾细胞及MLN淋巴细胞中Treg细胞的比率,下调Th17细胞的比率,且不同剂量组间差异有统计学意义(P<0.05)。关节滑膜组织中Treg/Th17:CIA模型组的CD4+Foxp3+Treg/CD4+T细胞比例与正常对照组无明显差异；ZCⅡ干预组则较正常对照组和模型组增多；CIA模型组CD4+IL17A+Th17/CD4+T细胞比例较正常对照组增多,ZCⅡ干预组则较正常对照组和模型组降低。4乌梢蛇CⅡ对CIA小鼠TGF-β及IL-17A的影响与正常组比较,CIA小鼠脾脏、MLN淋巴细胞培养上清及外周血中TGF-β和IL-17A水平上升；与CIA模型组比较,口服ZCⅡ可以上调CIA小鼠脾脏、MLN淋巴细胞培养上清及外周血中TGF-p的水平,抑制CIA小鼠脾脏、MLN淋巴细胞培养上清及外周血中IL-17A的水平,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论限制性胃蛋白酶降解法可以有效获得ZC Ⅱ。ZCⅡ的分子量介于110KD-140KD,紫外吸收峰为230nm左右,与Sigma鸡CⅡ标准品相近；ZCⅡ肽质量指纹图谱与其他物种有4个以上肽段匹配,蛋白评分大于95%,与其他物种的CⅡ具有较高的同源性；可为后续实验提供材料。口服乌梢蛇CⅡ能明显改善CIA小鼠的关节炎症,抑制关节滑膜细胞增生,减少炎性细胞浸润新生血管生成,降低软骨受损程度。口服ZCⅡ能够升高CIA小鼠脾脏、肠系膜淋巴结及关节滑膜组织中Treg的比例,同时降低Th17的比例；ZCⅡ促进Treg及其相关细胞因子TGF-β产生的同时抑制了Th17及致炎性细胞因子IL-17等的分泌,打破CIA小鼠的病理性免疫失衡,重新诱导CIA小鼠产生免疫耐受。