论文部分内容阅读
Pre-mRNA剪接由剪接体催化进行。剪接体是一个动态的大分子核糖核蛋白复合物，它的组装是一个逐步进行的过程，涉及到复杂的RNA-RNA和RNA-蛋白相互作用。即使在组装过程中发生微小错误都可能会使mRNA中发生碱基的插入、删除或移码突变，已知15％以上的人类疾病是由RNA剪接紊乱导致的，因此RNA剪接保真性机制研究具有重要的意义。属于ATP水解酶/RNA解旋酶的一类剪接因子（Sub2、Prp5、Prp28、Brr2、Prp2、Prp16、Prp22和Prp43）利用水解ATP的能量，解开RNA-RNA duplex或移除与RNA相互作用的蛋白，分别催化剪接体组装过程中的早期组装(Sub2和Prp5)、活化(Prp28和Brr2)、催化步骤（Prp2和Prp16）、后期组装（Prp22和Prp43）的构象重排。已有的研究表明，除了具有催化RNA剪接功能之外，其中4个剪接体ATP水解酶还参与调控剪接保真性的过程。但是目前仍有许多问题不清楚，比如:ATP水解酶的高级结构与剪接保真性的调控功能之间有什么关系？5剪接位点(splice site，SS)的精确选择是如何实现的？本研究从Prp5和Prp28的方面回答以上两个问题。 (1) Prp5的晶体结构揭示其分子内相互作用调控着RNA剪接的保真性 Prp5是一个DEAD-box蛋白，促进U2 snRNP结合到内含子的分支点(BS)区域，并在此过程中调控早期剪接体组装的保真性，然而它的结构一直没有得到解析。我们解析了Prp5(2.12(A))和Prp5p-ADP-Mg2+复合物两个晶体结构。与其它的DEAD-box蛋白不同，在结合RNA之前，Prp5的结构是一个新的扭转的“开放式”构象(twistedopen stateconformation)。它的ATP水解酶/解旋酶核心结构域(ATPase/helicase core domain)上保守的motif由广泛的分子内相互作用分别稳定在D1和D2的两个相反的面上。这些相互作用是由D2、侧翼序列和亚结构域(subdomain)间的linker形成的，包括疏水相互作用和一系列的氢键。进一步通过酵母遗传学方法、ATP水解活性测试和酶动力学分析证实:减弱这些分子内相互作用，Prp5p-ATP-RNA中间体的形成加快，其ATP水解酶活性提高，由此特异性地降低了次优BS区域底物（suboptimal branch region substrates）的剪接效率。最终从高级结构的层面揭示了Prp5调控RNA剪接保真性的动力学机制:在分支点识别的过程中，Prp5扭转的“开放式”构象必须重构形成“关闭式”构象，从而激活Prp5的ATP水解酶活性，使U2 snRNP稳定地结合到分支点区域，RNA剪接得以继续进行。扭转的“开放式”构象的稳定性与Prp5对RNA剪接的校正效果成反比。本研究首次发现了ATP水解酶在结合RNA之前的一个扭转的“开放式”构象，并第一次揭示了ATP水解酶的高级结构与它对RNA剪接保真性调控功能之间的关系。 (2) Prp28调控5SS剪接保真性的作用机制 已知在剪接体组装过程中，Prp28促进5SS-U1 snRNA配对向5SS-U6 snRNA配对转换的过程，调控剪接体活化所需的构象变化。然而，Prp28是否参与调控5SS剪接保真性还未证明。通过一系列的酵母遗传学筛选，分离到能够提高次优5剪接位点底物剪接效率的prp28突变体，并证明了野生型PRP28能够调控内含子5SS的剪接保真性，且Prp28的校正功能只与5SS:U6 duplex稳定性有关，而与5SS:U1 duplex稳定性无关。表型最强的E404K突变位于两个类RecA亚结构域间的linker上，体外实验证实其具有较低的RNA结合活性，并促进了次优底物第一步转酯反应的效率。根据这些结果提出了一个Prp28调控5SS剪接保真性的动力学模型:Prp28通过ATP水解促进的构象变化与5SS-U6 snRNA的配对速率相互竞争，阻断那些与U6 snRNA配对速率相对较慢的次优5SS底物的剪接过程。此外，酵母和果蝇S2细胞实验都证实了E404残基对剪接效率的维持至关重要。因此，本研究首次揭示了ATP水解酶亚结构域linker序列具有调节剪接保真性和剪接效率的双重功能。 然而，有关Prp5和Prp28的研究结果又留下了新的问题等待我们回答:除了RNA底物外，是否还需要其它剪接因子或生物大分子的参与调控Prp5扭转的“开放式”构象向“关闭式”构象转变的过程？为了进行下一轮的ATP水解酶过程，Prp5的“关闭式”构象如何重新回复到扭转的“开放式”构象？Prp28的linker序列是如何调节RNA剪接保真性或剪接效率的？在高等真核生物Prp28是否仍可以调节剪接保真性，只是需要其它辅因子的参与？