论文部分内容阅读
目的:细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)作为包虫病(hydatidosis)的主要病原体,给我国及世界各国造成了不计其数的危害,给人民群众造成了巨大的生命威胁。自了解包虫病以来,各国均采取积极手段研究对其的防治,因此包虫病的免疫预防就成为了当前研究的热点。基于此,研制针对宿主的包虫病长效保护疫苗,将对我国包虫病的防治起到促进作用。而截至目前,四跨膜蛋白(Tetraspanin,TSP)在广泛的细胞活动过程中起到重要作用,并已发现可对寄生虫宿主免疫互作及逃避起到积极作用,已经被发现可作为多种寄生虫宿主疫苗的候选蛋白。本研究将首次对E.g四跨膜蛋白TSP8、TSP11基因进行扩增及原核表达,并对其重组蛋白免疫小鼠体内的细胞因子及抗体水平进行检测,为研究四跨膜蛋白作为细粒棘球绦虫候选疫苗抗原奠定基础。方法:(1)细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11全长基因的克隆及序列分析根据NCBI GeneBank中细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11的全长基因,分别对其设计特异性引物,以细粒棘球绦虫的原头蚴cDNA为PCR模板进行扩增,并将PCR产物克隆至pMD19-T载体,送至测序,通过生物信息学软件分析预测TSP8、TSP11全长基因的结构与功能,并通过SYBR GreenⅠqRT-PCR方法分析TSP8、TSP11基因在E.g原头蚴以及成虫mRNA相对转录情况。(2)细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11主要抗原基因的克隆及原核表达为成功编码表达细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11基因,针对其主要抗原区域序列进行了特异性引物设计,对主要抗原区域片段进行克隆并测序。在测序正确的基础上,将目的片段与表达质粒pET-32a分别进行酶切与连接以及转化,建立pET-32a-TSP重组表达载体,并使用亲和层析柱法对其进行纯化、SDS-PAGE电泳对其进行鉴定及检测、Western blot免疫印迹法对其抗原性进行检测、以及通过免疫定位分析TSP8、TSP11蛋白在虫体的具体定位。(3)细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11免疫学特性分析试验分为4组,重组蛋白TSP8、TSP11组与PBS、佐剂对照组,每组共15只小鼠,分别对试验组进行免疫,以每只小鼠500μg蛋白含量与弗氏佐剂进行等体积混合免疫,每隔15天免疫一次,共免疫4次。第一次免疫为弗氏完全佐剂混合免疫,其余为弗氏不完全佐剂混合免疫。每次免疫后,各组取三只小鼠尾部采血并收集血清,以q-PCR方法测定Th1型(IFN-γ、TNF-β)、Th2型(IL-4、IL-5、IL-6、IL-10)两类免疫反应共6种细胞因子随免疫时间的变化、以及采用ELISA法测定其抗体水平的变化。结果:1、成功克隆到细粒棘球绦虫TSP8基因全长序列,TSP8基因共含有669个核苷酸,编码蛋白含222个氨基酸,相对分子质量为24 KDa。预测TSP8基因共含有2个潜在的N端糖基化位点,包含2个蛋白激酶磷酸化位点。编码TSP8基因的氨基酸序列共含有5个跨膜区域,推测含有4个优势B抗原表位,且qRT-PCR结果显示TSP8基因在E.g原头蚴及成虫阶段均有表达,但在成虫阶段的表达水平较高,具有统计学差异(p<0.05)。2、经克隆获得TSP11全长基因,TSP基因全长765个核苷酸,编码蛋白含254个氨基酸,相对分子质量为29.02KDa,预测其含有3个潜在的N端糖基化位点、5个蛋白激酶磷酸化位点以及1个酪氨酸激酶磷酸化位点。编码TSP11基因的氨基酸序列共含有3个跨膜区域,推测含有7个优势B抗原表位。qRT-PCR显示其在E.g原头蚴及成虫阶段均有表达,无统计学显著差异(P>0.05)。3、重组蛋白Eg-TSP8、Eg-TSP11在免疫小鼠2周时,就可在小鼠血清中检测出特异性IgG抗体,并发现在随后的加强免疫中,血清中的特异性IgG抗体水平逐次升高,表明该重组蛋白能诱导小鼠体内产生特异性的抗体,具有比较好的免疫原性。重组蛋白Eg-TSP8在首免2周后,检测到脾组织中IL-5、IL-10相对于佐剂组与PBS组有较高水平表达(P<0.01)。而重组蛋白Eg-TSP11在第三次加强免疫后,能在脾组织中检测到细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10水平,均比佐剂组与PBS有显著高水平表达(P<0.01)。可见,重组蛋白Eg-TSP11诱导小鼠产生了Th1/Th2免疫反应,而重组蛋白Eg-TSP8主要偏向于Th2免疫反应。结论:重组蛋白Eg-TSP8、Eg-TSP11均具有免疫原性,但Eg-TSP11蛋白相较于Eg-TSP8蛋白能刺激小鼠产生Th1型免疫应答,具有成为包虫病候选疫苗抗原的潜力。