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甘草次酸作为甘草药用成分的一种,具有抗病毒、抗菌、抗艾滋病、防治肿瘤等多种药理活性,被广泛应用于食品、化妆品、医药等多个领域。本实验室前期构建得到了一株合成甘草次酸的酵母工程菌C-CPR12,但甘草次酸的产量很低,其中由P450酶CYP72A154催化的11-氧-β-香树脂醇到甘草次酸的氧化过程是甘草次酸合成的重要限制步骤。因此,本研究在前期研究基础上,以单倍体酿酒酵母CENPK2-1C为宿主,设计构建11-氧-β-香树脂醇途径,并进行CYP72A154的半理性突变,期望提高酶的催化活性和甘草次酸的合成水平。主要研究结果如下:以实验室保藏的质粒为模板扩增β-香树脂醇基因bAS（源于Glycyrrhiza glabra）、单加氧酶基因CYP88D6（源于Glycyrrhiza uralensis fisch）和细胞色素还原酶基因AtCPR1（源于Arabidopsis thaliana）,利用OE-PCR的方法构建基因表达盒,成功将11-氧-β-香树脂醇合成途径整合到酵母菌株CEN.PK2-1C内,得到工程菌CO。通过气相色谱质谱联用仪检测到酵母工程菌CO成功合成了11-氧-β-香树脂醇,产量达到8.37 mg/L,说明在酵母中成功构建了11-氧-β-香树脂醇的合成途径,为半理性改造CYP72A154提供了宿主基础。为提高CYP72A154活性,借助CYP450数据库分析了P450酶底物结合口袋（SRSs）的功能位点,确定了6个突变位点。通过定点突变方法成功获得了CYP72A154的6个突变体和酵母菌株（V148T、G238F、W344Y、I382Y、R446A、L508V）,通过测定氧化还原反应产生的活性氧水平和甘草次酸的合成水平确定出了有利突变V148T,发现工程菌V148T的细胞内外活性氧水平最低,对细胞毒性小,甘草次酸合成量达到最高值46.812μg/L,较对照菌GAO增加了1.59倍。为提高酵母工程菌在合成甘草次酸中的前体物供应,研究以实验室前期构建的工程菌ScM（过表达了乙酰乙酰辅酶A转移酶基因ERG10、HMG辅酶A合酶基因ERG13、HMG辅酶A还原酶基因tHMG等基因）和Sgib（过表达了二磷酸异戊烯酯异构酶IDI、焦磷酸合酶ERG20、鲨烯合酶ERG9等基因）为宿主,导入11-氧-β-香树脂醇的合成途径和突变体pRS42K-V148T,产生的工程菌GA1、GA2分别合成了96.5μg/L和83.7μg/L的甘草次酸,分别比优化前的V148T菌株增加了106%和78.8%。进一步从氧化还原整体体系出发,通过在工程菌GA1中共表达酿酒酵母细胞色素氧化酶基因CYB5和来源于拟南芥的细胞色素还原酶AtCPR2,使甘草次酸产量提高到125.92μg/L。通过过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶ZWF1和NADH激酶POS5,增强细胞内NADPH供应水平,使甘草次酸产量达到182.37μg/L。从基础发酵条件碳源、氮源、pH、温度、接种量方面优化了发酵条件,确定了最佳发酵条件:葡萄糖10 g/L、蛋白胨20 g/L、接种量为OD600=0.1、pH为6、发酵温度为28°C。利用乙醇补料发酵,甘草次酸的产量达到782.6μg/L,比初始对照菌提高了42.43倍。上述结果表明,甘草次酸合成途径在酿酒酵母内成功构建,经过关键酶、途径和发酵工艺优化,显著提高了甘草次酸合成水平。