【摘 要】
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目的:（1）研究在结核病人外周血样本中,尤其是结核病潜伏感染组IL15的特异性表达水平差异。（2）构建DNA疫苗pVAX1-IL7-Ag85A并检测其免疫保护效应。探索该疫苗在小鼠免疫实验中的免疫应答表现,评价该疫苗用于预防结核病感染的作用和潜力。方法:（1）根据临床样本的不同来源,将100例临床外周血样本分为活动性结核组、潜伏感染组、非结核其他呼吸系统疾病组和健康对照组。用分枝杆菌潜伏感染相关抗
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（编号31572485,31772709）；
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目的:（1）研究在结核病人外周血样本中,尤其是结核病潜伏感染组IL15的特异性表达水平差异。（2）构建DNA疫苗pVAX1-IL7-Ag85A并检测其免疫保护效应。探索该疫苗在小鼠免疫实验中的免疫应答表现,评价该疫苗用于预防结核病感染的作用和潜力。方法:（1）根据临床样本的不同来源,将100例临床外周血样本分为活动性结核组、潜伏感染组、非结核其他呼吸系统疾病组和健康对照组。用分枝杆菌潜伏感染相关抗原Rv2626c,Rv2031,Rv2028c,Rv2029c,Rv3406和Rv1738等刺激全血样本48小时后取上清,用双抗体夹心法测定IL15表达水平。（2）PCR扩增IL7和Ag85A目的序列,双酶切连接插入载体p VAX1中,涂板培养后筛取阳性克隆送测序鉴定。挑选两批5-6周龄的Balb/c雌性小鼠,每批19只,分为PBS对照组、p VAX1空载组、p VAX1-IL7、p VAX1-IL7-Ag85A组。将1μg/μL浓度的各组质粒分别肌肉注射到小鼠双大腿中,两腿各50μL。PBS组注射等量的无菌PBS溶液。每2周免疫一次小鼠,共免疫6周。免疫完成后2周将小鼠处死。另一批小鼠在免疫完成3周后用H37Rv菌株气雾攻击感染后再处死。获取淋巴细胞进行流式细胞仪分析及组织匀浆后涂板计数。结果:（1）临床外周血样本在没有潜伏感染相关抗原刺激的情况下,IL15的本底表达水平有变化。使用本实验室前期构建好的潜伏相关抗原刺激后,结核病潜伏感染组高于活动性结核组、非结核其他呼吸疾病及健康对照组（p<0.001）。Rv2031抗原刺激后,此种差异最为明显。（2）成功构建了DNA疫苗p VAX1-IL7-Ag85A。小鼠免疫实验结果显示,p VAX1-IL7-Ag85A疫苗可以引起多功能CD4+T细胞中IFN-γ+TNF-α+亚群免疫应答,小鼠感染H37Rv后肺CFU计数及HE染色结果佐证了这一点。结论:（1）在不同临床组别中均能检测到IL15的表达,IL15的本底表达水平有变化,说明IL15本身就与机体免疫保护效果直接相关。Rv2031抗原刺激后,此种差异最为明显,说明Rv2031有潜力作为以IL15的表达水平鉴别诊断活动性结核和结核病潜伏感染的备选抗原。（2）本实验成功构建并鉴定了用于小鼠实验的DNA疫苗p VAX1-IL7-Ag85A。分析了DNA疫苗p VAX1-IL7-Ag85A对免疫后的小鼠体内多功能CD4+T细胞亚群尤其是IFN-γ+TNF-α+亚群的免疫应答和CD8+记忆性T细胞应答可能具有一定诱导作用。
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