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研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)发病率近年来在全球呈现上升趋势,2011年全球大约有3.65亿DM患者,预计到2030年将达到5.52亿人。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是指发生于DM患者,同时又不能用高血压心脏病、动脉粥样硬化心脏病、心脏瓣膜病等其他的心脏病变来解释的心肌病变。DCM常引起突发的心脏死亡,是DM人群致死致残的主要原因之一。该病的病理改变主要表现为心肌细胞肥大、凋亡、坏死,肌丝纤维大量破坏和丢失,心肌细胞外间质有不溶性的胶原蛋白积聚,从而导致心脏纤维化。DCM随着时间的发展,心肌最终代偿失败,进展为心力衰竭、心律失常及心源性休克。降低血糖可以显著预防DCM的发生,但是降糖治疗并不是唯一的预防策略,并且DCM发生的病理生理机制复杂,有必要进行进一步的深入研究,找出除了血糖以外其他的关键因子。针对这些因子进行干预,作为预防糖尿病性心肌病的新靶点。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一类由内源基因编码的,高度保守的非编码单链RNA小分子,约由18-25个核苷酸构成。通过对功能蛋白的信使RNA(message RNA,m RNA)进行降解或翻译抑制,对其蛋白表达水平进行调节,从而参与许多重要的生理病理过程的调控。研究发现多种疾病的发生发展过程都伴随着mi RNA的异常表达,并且对疾病进程有着重要的调控作用。研究目的:通过mi RNA基因芯片和实时定量PCR技术筛选和确认DCM动物模型心肌组织中异常表达的mi RNAs;明确mi R-144在DCM发生发展中的作用和调控机制;并探索mi R-144作为DCM干预靶点的可行性。研究方法:1、DCM动物模型的建立将30只健康SD大鼠(8周龄)随机分成两组:DCM组(n=15)和对照组(n=15)。DCM组通过1次腹腔注射链脲霉素(streptozotocin,STZ,60 mg/kg),对照组腹腔注射相应体积的柠檬酸缓冲液,常规饲料喂养8周。以血糖指标确认1型DM建模成功,以心肌病理组织改变确认DCM建模成功。将40只健康C57BL/6小鼠(6周龄)随机分成两组:DCM组(n=20)和对照组(n=20)。DCM组通过1次腹腔注射STZ(150 mg/kg),对照组腹腔注射相应体积的柠檬酸缓冲液,常规饲料喂养8周。以血糖指标确认1型DM建模成功,以心肌组织病理改变确认DCM建模成功。2、原代乳鼠心肌细胞培养及高糖刺激将出生1~2 d的SD乳鼠,75%酒精消毒后取出心脏,剪去心房,用预冷的D-Hanks缓冲液洗涤心室肌组织。将心肌组织剪碎后,用1%的II型胶原酶4℃消化过夜,收集细胞并计数后,接种于12孔板,用完全培养液培养2 h后,去除未贴壁细胞和培养液后,更换新的完全培养基继续培养。分离的心肌细胞用无血清培养基预处理12 h,用高糖培养基(25m M)刺激24 h,诱导心肌细胞损伤,观察细胞形态变化,检测基因表达变化。3、基因表达变化的检测mi RNA基因芯片:利用TRIzol试剂提取组织或细胞的总RNA,经质检后,样本RNA标记,利用Agilent mi RNAs基因芯片系统检测异常表达的mi RNA。实时定量PCR:根据提取RNA样本的质量,mi RNA利用茎环结构的特异性引物合成mi RNA的c DNA,编码基因利用oligo d T和随机引物合成c DNA。经实时定量PCR检测,mi RNA以RNU6b为内参,编码基因以GAPDH为内参,计算相对表达水平。4、mi R-144的过表达和沉默表达mi R-144 mimic:一条化学合成的双链短RNA,正义链与mi R-144成熟序列完全一致,反义链与其互补配对。Mi R-144 inhabitor:是通过化学合成的,专门作用于mi R-144的抑制剂。mi R-144 antagomir:根据mi R-144的成熟序列,化学合成其反义互补序列,并以2’甲氧基修饰的单链RNA。将mimic(25 nmol/L)或inhabitor(25 nmol/L)利用脂质体转染的方法在心肌细胞中过表达或沉默mi R-144,通过实时定量PCR的方法检测确认。将antagomir(20 mg/kg)通过每周两次尾静脉注射的方法沉默小鼠全身mi R-144水平。5、mi R-144对高糖诱导的心肌细胞氧化应激和凋亡的作用原代培养乳鼠心肌细胞,接种于细胞培养板中。高糖培养基刺激细胞的同时,在心肌细胞中过表达/沉默mi R-144。活性氧荧光探针法检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成的变化,流式细胞术检测心肌细胞凋亡变化。6、mi R-144靶基因的筛选及确认生物信息学预测:通过mi RNA在线预测数据库Target Scan、Pic Tar和mi Randa等,根据mi R-144的种子序列及空间结构,对其潜在靶基因的3’UTR序列进行分析,筛选结合位点亲和力高,序列进化高度保守的基因;双荧光素酶报告基因验证:将mi R-144的潜在靶基因3’UTR序列亚克隆至PGL3质粒报告基因的3’UTR区域。并将其与mi R-144过表达载体、荧光内参载体共转染293T工具细胞;分别检测报告基因和内参基因的荧光信号,计算相对比值,确定mi R-144是否抑制带有潜在靶基因3’UTR序列的报告基因表达;细胞内源型蛋白表达检测:在原代培养乳鼠心肌细胞中过表达/沉默mi R-144水平,利用实时定量PCR和western blot的方法分别检测潜在靶基因的m RNA和蛋白表达变化,确定mi R-144对靶基因的调控途径。7、mi R-144对DCM发生发展的影响将100只C57BL/6小鼠(6周龄)随机分成4组,分别为空白对照组(n=25)、mi R-144组(n=25)、DCM组(n=25)和DCM/mi R-144组。DCM组采用腹腔1次注射STZ(150 mg/kg)的方法诱导;空白对照组腹腔注射相应体积的柠檬酸缓冲液;mi R-144组在空白对照组基础上行每周2次尾静脉注射mi R-144antagomir(20 mg/kg);DCM/mi R-144组在DCM基础上行每周2次尾静脉注射mi R-144 antagomir(20 mg/kg)。常规饲料喂养8周,以血糖和心肌病理改变确认1型DM建模成功。心脏彩超检测心功能改变;HE染色检测心肌心肌组织病理改变,Masson染色检测心肌纤维化改变;TUNEL法检测心肌细胞凋亡数目;活性氧荧光探针法检测细胞内ROS生成的变化;Elisa法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;实时定量PCR和western blot检测相关标志物的表达变化。研究结果:(1)mi RNA芯片结果显示,DCM大鼠血浆和心肌组织中mi RNA的表达水平出现明显紊乱,其中血浆mi RNA都出现了明显升高,最显著的是mi R-29b,较对照组升高37倍。心肌组织中mi RNA的表达差异较小,其中mi R-344a升高最显著,为对照组的4.3倍;mi R-144降低最显著,是对照组的25.5%;实时定量PCR结果证明mi R-144在DCM小鼠心脏组织中表达明显降低,为对照组的40%,在高糖诱导的心肌细胞中表达也明显降低,为对照组的60%。(2)高糖刺激条件下,原代培养的心肌细胞其细胞内活性氧生成增加,细胞凋亡增加,心肌细胞面积明显增加,心钠素(Atrial natriuretic factor,ANF)的m RNA水平明显增加;同时转染mi R-144抑制剂可以减轻高糖诱导的心肌细胞氧化应激和细胞凋亡,减轻高糖诱导的心肌细胞肥大并抑制ANF表达。生物信息学预测发现在很多基因的3’UTR区域存在mi R-144的结合位点,其中核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)m RNA的3’UTR上有3个mi R-144的靶点;双荧光素酶报告基因系统检测发现在工具细胞中过表达mi R-144,能够显著抑制带有Nrf2基因3’UTR序列的荧光素酶活性,而不影响含突变靶点的荧光素酶活性;western blot结果发现心肌细胞中过表达mi R-144后,Nrf2蛋白水平明显降低。(3)利用STZ建立DCM小鼠模型,同时尾静脉注射antagomir的方法干预mi R-144水平。建模8周后,发现DCM小鼠心脏中Nrf2蛋白表达减少,丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平增加;caspase-3剪切体的生成增加,TUNEL染色发现心脏组织中凋亡细胞数目增加;左心室相对重量明显增加,HE染色发现心肌细胞呈现肥大,活性氧(ROS)水平增加;Masson染色发现心肌纤维明显增加;心肌ANF和β肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)的m RNA水平明显增加,心脏纤维化相关基因转化生长因子β(Transforming growth factorβ,TGF-β)和胶原α1链(Col1A1)的m RNA水平明显增加;心功能相关指标缩短分数(Fractional shortening,FS)、射血分数(Ejection fraction,EF)、肌力作用指标+d F/dt max和-d F/dt min明显下降。经mi R-144 antagomir治疗后,Nrf2蛋白表达增加,MDA水平明显降低;caspase-3剪切体的生成减少,细胞凋亡减少;左心室相对重量减轻,心肌细胞肥大得到缓解;ROS水平明显降低;心肌纤维化减轻;ANF、β-MHC、TGF-β、Col1A1的m RNA水平明显降低;FS、EF、+d F/dt max、-d F/dt min得到恢复。结论:1型糖尿病模型鼠中mi R-144水平降低可能是心脏内在的抗糖尿病代偿保护机制之一。体外条件下,给予外源性的mi R-144抑制剂进行治疗可以通过增加Nrf2蛋白表达,抑制高糖诱导心肌细胞的氧化应激,从而减轻高糖诱导的细胞凋亡和肥大。在1型糖尿病小鼠模型中给予mi R-144拮抗剂进行治疗,可以减轻心肌内氧化应激、凋亡、心肌肥大、纤维化,从而改善小鼠心脏功能。mi R-144可以成为抗糖尿病心肌病的一个重要的新颖的靶标分子。