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大量流行病学资料证实了人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)与动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的发生和发展有密切关系。研究证明，HCMV的抗原及DNA序列存在于AS的病灶组织中，且主要集中于血管内皮细胞(Vascular endothelial cells，VEC)。但是，HCMV感染是否是人类AS形成的致病因子，以及HCMV是如何引起VEC的损伤?目前尚不十分明确，这就为我们提出了新课题。因为VEC的特殊结构位置和丰富功能，而被认为是损伤动脉形成粥样硬化发病过程中重要的始动环节。 VEC不仅是血管内膜的生理屏障结构，而且具有多方面的分泌功能，其合成的前列环素、血栓素、内皮素及其表面的血栓调节素、ADP酶、一氧化氮等在抗血小板聚集、血栓形成、细胞黏附和抑制平滑肌细胞增殖方面发挥重要作用。VEC损伤势必可以促进大血管病变尤其是AS的发生和发展。 目前，对银杏黄酮甙研究较多，但大都集中在临床防治AS的作用，认为它对于心血管系统具有扩张血管，改善缺血心肌血液供应，清除自由基和拮抗体内外多种细胞释放的血小板激活因子(PAF)等作用。然而，有关其调节VEC功能以及是否具有保护HCMV感染VEC的具体机制方面的研究尚未见报导。 第四军医大檬硕士学位论久 1.目的 (1)观察HCMV感染VEC后，引起VEC的增殖、凋亡、细胞周期、及NO分泌量的影响，在细胞和分子水平探讨HCMV对VEC结构和功能的影响及可能机制。 (2)观察银杏黄酮贰对HCMV感染后VEC增殖、凋亡、细胞周期、及NO分泌量的影响，为临床应用银杏黄酮贰提供理论依据。 2.方法 (l)本实验分为4组，分别为正常对照组，即正常培养的人脐静脉内皮细胞(Human umbilsea一vein endothelial ce一，HUVEC304);银杏黄酮贰组，即在培养的直uvEc304内加入银杏黄酮贰;HcMV感染组，即在培养的HUVEC304内加入HCMV;HCMV感染+银杏黄酮贰组，即在培养的HUVEC304内感染HCMV并加入银杏黄酮贰。 (2)利用相差显微镜观察正常HUvEC304的形态学情况;应用透射电镜观察HCMV感染体外培养的HUVEC304的超微结构改变和病毒的繁殖情况，并观察银杏黄酮贰对其的影响。 (3)应用MTT比色法在酶联免疫检测仪上检测HCMV感染体外培养HUVEC304的增殖情况;应用流式细胞仪技术在荧光激活细胞分选仪(FACS)上进行HCMV感染体外培养的HUVEC304周期和细胞凋亡的检测和分析;并观察银杏黄酮贰对其影响。 (4)用硝酸还原酶法检测HCMV感染体外培养HUVEC304的NO分泌量;及银杏黄酮贰对HCMV感染HUVEC304 NO的分泌量的影响。 3.结果 (l)利用相差显微镜观察到培养三天左右的HUvEC304融合成片，外观呈现特征性的“鹅卵石”样形态，排列致密，胞浆丰富，在集落边缘常见双核细胞，两个核的大小形态相似，相邻存在。利用透射电镜技术观察到完整的内皮细胞整体形态，细胞内的细胞器的形态，及其特有的Weibel一Palade小体(w一P小体)。但 第.军医大李硕士学位论义是，HCMV感染的HUvEC304胞体肿胀，胞核偏位，线粒体收缩甚至部分己消失呈空泡状，溶酶体变性，粗面内质网扩张，同时也可以看到病毒在细胞内繁殖的各个时期的形态。 (2)HCMV感染对体外培养的HUVEC304增殖水平、细胞周期、细胞凋亡及分泌NO的检测结果显示:HCMV可以促进HUVEC304增殖(分别为1 .09士0.08和2.08士0.09，较对照组增加91%，P<0.05);可以降低HUVEC304停留在Gl期的细胞 (GO/GI期的细胞分别为74.4%和59.3%，较对照组降低203%，尸<0.05);可以抑制细胞的凋亡(凋亡细胞分别为8.3%和5.8%，较对照组降低30.1%，尸<0.01);可以使HUVEC304的NO分泌水平显著降低(分别为174士9“mol/L和9s士5“mol/L，较对照组降低44%，尸<0.01)。 (3)银杏黄酮贰对HUvEC304增殖、细胞周期、细胞凋亡及NO分泌量的检测结果显示:银杏黄酮贰可以直接作用于HUVEC304，使之在一定程度上增殖(MTT光吸收值分别为1 .09士0.08和1.24士0.05，较对照组增加14%，尸<0，05)，并存在剂量依赖性;银杏黄酮贰降低HUVEC304停留在Gl期的细胞(GO/GI期的细胞分别为74.4%和71 .2%，较对照组降低4.3%，尸<0.05);可以增加HUVEC304的凋亡水平(凋亡细胞分别为8.3%和9.3%，较对照组升高12.0%，P<0.01);可以使HUVEC304的NO分泌水平升高(分别为174士9 p mol几和185士4协mol几)。 (4)银杏黄酮贰对HCMV感染HUvEC304增殖、细胞周期、细胞凋亡及NO分泌量的检测结果显示:银杏黄酮贰可以抑制HCMV感染的HUVEC304的增殖作用(吸收值分别为2.08士0.09和1.97士0.22，较HCMv组降低5%，办0.05);银杏黄酮贰可以降低HCMV增加进入S和GZ/M期的细胞(GO/GI期的细胞分别为59.3%和67.5%，较感染组增加13.8%，尸<0.05);银杏黄酮试可以促进HCMV感染HUVEC304细胞的凋亡(凋亡细胞分别为5.8%和6.2%，较HCMV组升高6.9%，尸<0.05);银杏黄酮贰可以升高HCMV作用HUVEC304后NO的分泌水平(分别 ·4- 第.军凌大李硕士学位论大?