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前言:
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是引起人类原发性非典型肺炎、支气管炎、咽炎等呼吸道疾病的常见病原体,除呼吸道外,尚可引起其它多系统、多器官的肺外并发症。肺炎支原体没有细胞壁,对作用于细胞壁的抗生素不敏感。因此,Mp感染的病原学诊断对于疾病的及时正确治疗有重要意义。对Mp感染的实验室诊断,主要是通过支原体分离培养、血清学检测和分子生物学方法检测核酸,而这些方法存在着各自不同的优缺点,因此,到目前为止,国内外对Mp的实验室诊断没有统一的标准。目前肺炎支原体诊断方法中所存在的局限性更突显了建立一种高灵敏度、高特异性、经济方便的检测方法的迫切需求。本研究基于QDs标记技术,通过建立鼠肺炎支原体感染模型,探讨QDs标记技术检测肺炎支原体的特点及在临床应用的可行性。
方法:
1、量子点标记兔抗肺炎支原体P1重组蛋白的IgG抗体制备。
采用碳二亚胺盐连接法,使量子点QD605的羧基与抗体上的氨基反应,形成肽键。然后用离心法纯化偶联产物,纯化后采用膜直接免疫荧光法验证量子点QD605与抗体的偶联,并采用荧光分光光度法对其荧光效率进行检测。
2、建立鼠肺炎支原体感染模型。
3、以CdSe/ZnS量子点标记兔抗肺炎支原体P1重组蛋白IgO作为检测抗体,对不同感染时期的鼠支气管灌洗液标本进行检测,观察CdSe/ZnS量子点标记方法检测肺炎支原体感染阳性率与病程的关系。
4、用CdSc/ZnS量子点标记方法对105份临床呼吸道感染标本进行测定,并与聚合酶链反应(PCR)检测法进行比较,计算两种方法的符合率。
结果:
1、量子点与肺炎支原体P1重组蛋白多克隆抗体的偶联结果
膜直接免疫荧光法表明只有偶联产物与Mp抗原反应在紫外灯下发荧光,单独的量子点QD60s、未标记的抗体及其它对照与Mp抗原反应在紫外灯下均不发荧光,验证了量子点QD605与抗体的偶联。然后采用荧光分光光度法对量子点QD605及偶联产物的荧光效率进行检测,结果显示两者并没有明显的改变,说明偶联产物的荧光强度没有受到偶联过程的影响。
2、动物实验感染的一般状况及肺指数测定
感染肺炎支原体后小鼠的肺指数明显升高,其中感染后3天和7天升高明显,分别为2.78%和2.99%,随着病程的延长肺指数逐渐下降。
3、量子点标记抗体法及PCR法检测感染鼠标本中Mp抗原
小鼠感染第3天和第7天PCR检测阳性率为分别为91.7%和100%,量子点标记抗体法阳性率分别为75%和83.3%。随着病程进展两种检测方法的检测阳性率逐渐下降。
4、105份临床标本检测结果
PCR阳性率为35.2%(37/105);量子点标记方法阳性率为31.4%(33/105),略低于PCR检测方法,两者符合率达86.7%(91/105),经x2检验,两方法的检测结果无显著性差异(x2-0.643,P＞0.05)。
结论:
量子点标记方法适用于肺炎支原体感染早期的检测,方法操作简单、检测快速,在临床实验室诊断中具有良好的应用前景。