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由柑橘间座壳菌Diaporthe citri引起的黑点病是目前我国柑橘产区最重要的病害之一。前人研究认为其“黑点”症状是柑橘在D.citri侵染过程中通过激活宿主防御反应导致植物细胞死亡的结果,涉及植物细胞的增生与植物保卫素香豆素的合成。然而该防御反应过程仍缺乏基因转录调控的直接证据,本研究采用RNA-Seq研究了柑橘叶片响应D.citri侵染时的基因表达模式。此外,微生物组作为构成植物共生体的重要组成部分,许多研究都报道了植物通过调控其根际微生物组的群落结构与功能组成响应病原菌侵染并有益于植物宿主的证据,然而叶际微生物组如何响应病原菌的侵染尚未有过系统性的研究。本研究基于柑橘宿主对D.citri侵染反应的特点,通过16S扩增子测序与宏基因组测序比较了自然发病与未发病叶片的微生物组差异。在此基础上,从发病叶片分离鉴定与D.citri侵染响应相关的细菌,并通过皿内对峙与温室接种等试验检测其对D.citri的拮抗功能。结果总结如下:1.柑橘宿主响应D.citri侵染的基因表达模式利用RNA-Seq技术分析比较D.citri接种与对照接种3 d（前期）和14 d（后期）的柑橘叶片转录组。在侵染前期,共检测到1994个基因上调表达,1464个基因下调表达;在侵染后期,共检测到1666个基因上调表达,1365个基因下调表达。通过功能富集分析比较柑橘叶片在D.citri侵染前期与后期的基因功能调控差异,发现与植物细胞壁生物合成相关的基因主要在侵染前期响应,而与植物胼胝沉积相关的基因在侵染后期的转录表达更为强烈,其中参与植物胼胝沉积防御反应的基因主要属于细胞色素P450家族;与植物保卫素香豆素合成、调控相关的基因通路被激活,其中香豆素及其衍生物合成的关键酶阿魏酰辅酶A 6’-羟化酶F6’H1和莨菪亭素8’-羟化酶S8H的编码基因在侵染后期比在侵染前期的转录表达更为强烈。此外,本研究结果还表明调控植物细胞壁果胶甲酯化的果胶甲酯酶编码基因PME17在侵染后期呈现出高表达响应（log2fold-change=25.7）,而PME17基因在侵染前期没有检测到差异表达。2.柑橘叶际微生物组对D.citri侵染的响应通过16S扩增子、宏基因组测序联合微生物共现网络、基因组分箱分析比较了D.citri侵染与未侵染柑橘叶片的微生物组差异。与未侵染叶片相比,D.citri侵染叶片的微生物组结构发生改变,突出表现为叶际内生细菌群落均匀度显著降低（从0.50下降至0.36）,富集新的叶际附生细菌ASVs（amplicon sequence variants）,及呈现加剧的叶际细菌网络关系（微生物节点平均连接数为11.95）。此外,本研究还从功能角度解析柑橘叶际响应D.citri侵染的微生物组特征,包括微生物代谢（如碳水化合物代谢及氨基酸代谢等）、铁元素竞争（如“铁复合体外膜受体蛋白”）、潜在抗真菌特性功能特征的富集,及具有有益基因组特征的Sphingomonas spp.类群的富集。其中Sphingomonas spp.是在D.citri侵染叶片中“铁复合体外膜受体蛋白”微生物功能富集的主要贡献类群,53.7%的宏基因组非冗余基因注释为Sphingomonas。3.柑橘叶际细菌对D.citri的拮抗作用通过双侧标签PCR扩增法高通量分离培养并鉴定了94个叶际附生细菌ASVs。选择12株响应D.citri侵染而富集的细菌进行皿内拮抗活性检测,发现有7株细菌对D.citri具有拮抗作用。其中Sphingomonas asv20、Pantoea asv90和Methylobacterium asv41表现出较强的拮抗活性,对D.citri的菌丝生长抑制率分别为40.8±4.2%、39.2±1.2%和36.8±1.5%。温室接种试验表明,Sphingomonas asv20、Pantoea asv90、Methylobacterium asv41和Mucilaginibacter asv102对宿主具有不同程度的保护作用,病情指数下降幅度为65.7–88.4%。皿内对峙试验揭示了Sphingomonas利用铁元素竞争的拮抗机制,Sphingomonas asv20在限铁条件下比在富铁条件下具有对D.citri更强的抑菌作用。基因组分析结果表明,Sphingomonas asv20拥有99个编码Ton B依赖受体的基因,其中45个基因注释为“铁复合体外膜受体蛋白”。综上所述,本研究通过多组学联合分析解析了柑橘叶片应对D.citri侵染时宿主转录组及叶际微生物组的响应模式,揭示了柑橘宿主通过激活防御反应响应D.citri侵染的转录调控证据,揭示了柑橘叶际微生物组响应D.citri侵染并赋予宿主防御功能的潜在机制。这些结果为深入研究和理解微生物组–病原菌–植物宿主三方互作关系提供新的思路。