【摘 要】
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硫氧还蛋白(Trx)是一类高度保守的蛋白,存在于多种生物中,在生物抗氧化应激和维持二硫键以保持蛋白正确功能等方面发挥着重要作用。杀鱼爱德华氏菌是一种危害严重的鱼类致病
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硫氧还蛋白(Trx)是一类高度保守的蛋白,存在于多种生物中,在生物抗氧化应激和维持二硫键以保持蛋白正确功能等方面发挥着重要作用。杀鱼爱德华氏菌是一种危害严重的鱼类致病菌,但其致病机制还很不清晰。基因组分析表明杀鱼爱德华氏菌编码了三种硫氧还蛋白,分别是A型硫氧还蛋白(TrxA)、C型硫氧还蛋白(TrxC)和H型硫氧还蛋白(TrxH),但它们的生物学功能尚不清楚,尤其是TrxH,目前还没有关于病原菌TrxH作用机制研究的报道。基于此,本研究旨在阐述杀鱼爱德华氏菌TrxH在细菌抗逆性和致病性中的作用。通过对杀鱼爱德华氏菌TrxH蛋白序列和结构分析,本研究发现H型硫氧还蛋白具有保守基序WCXXC和QSTL,二级结构分析表明该蛋白存在5个α螺旋和4个β折叠。借助于荧光定量PCR对trxH基因的表达进行了研究,结果表明在氧化应激、缺铁、低pH等逆境条件下以及感染宿主细胞时trxH的表达显著上调,这些结果表明TrxH很有可能在细菌适应逆境环境和宿主胞内环境等方面发挥作用;同时发现trxH的表达受到杀鱼爱德华氏菌全局性调控因子----铁调节因子Fur的负调控,这是首次发现TrxH受Fur调控。为研究trxH的生物学功能,本研究利用同源重组技术对trxH进行了缺失突变,获得了trxH缺失突变株TX01(35)trxH,比较分析了野生株TX01和缺失突变株TX01(35)trxH在生长状况、生物膜形成、抗逆性和抗血清杀菌能力等方面的差异,结果发现trxH的缺失对细菌的生长状况没有影响,但显著减弱了细菌抵御缺铁、酸性环境、氧化环境等抗逆性能力,显著降低了细菌生物膜形成能力和抗血清杀菌能力;体外实验表明,trxH的缺失显著降低了细菌对宿主细胞的侵染能力和在巨噬细胞中的存活能力;体内实验表明,与野生株TX01相比,trxH突变株TX01(35)trxH侵染宿主组织的能力大幅下降,引发宿主的死亡率也显著降低。本研究构建了突变株TX01(35)trxH的互补株TX01(35)trxHC,发现互补株在上述抗逆性能力和致病性能力与野生株相当。本研究在鱼类致病菌中研究H型硫氧还蛋白的功能,结果表明杀鱼爱德华氏菌TrxH在细菌抗逆境环境和致病过程中发挥了重要作用,是该菌的一个重要毒力因子。本研究结果有助于进一步阐明鱼类致病菌杀鱼爱德华氏菌的致病机制,可为其他水产致病菌硫氧还蛋白的研究提供参考,并为包括杀鱼爱德华氏菌在内的水产病原菌的防治提供一定的理论基础,为水产养殖业的绿色、健康及可持续发展奠定基础。
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