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研究背景和目的:急性肺损伤(acute lung injury, ALI)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)、肺炎、肺水肿等多种肺部疾病都伴随肺泡上皮屏障的破坏,肺泡上皮屏障的修复直接关系到患者预后。肺泡上皮屏障由肺泡Ⅰ型上皮细胞(alveolar epithelial cells typeⅠ, AECⅠ)和Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial cells typeⅡ,AECⅡ)构成,其中AECⅡ作为肺泡上皮细胞的干细胞,可在肺损伤后通过有丝分裂增殖补充自身的数量,并向AECⅠ转分化来修复肺泡上皮屏障。因此,了解AECⅡ增殖和转分化机制对肺部疾病的治疗具有重要意义。转化生长因子β1(transforming growth factorβ1, TGFβ1)介导的Smad通路是AECⅡ增殖和转分化中的重要通路。TGFβ1/Smad通路的激活可以显著抑制AECⅡ增殖和转分化,影响肺泡上皮屏障的修复。小窝(Caveolae)是细胞质膜表面特异性的内陷微区,直径约50～100nm,主要由小窝蛋白(Caveolin)、胆固醇、糖基鞘磷脂、鞘磷脂组成。Caveolae主要存在于高度分化的细胞,在内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞中尤为丰富,是正常细胞行为所必须的、具有特殊功能的膜结构。Caveolae是细胞内外信息传递和物质交换的重要通道,在多种细胞增殖及分化中起重要作用,但在AECⅡ增殖和分化中的作用尚不明确。为此本实验通过甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin, MβCD)干预体外培养的大鼠AECⅡ细胞膜Caveolae结构,研究其对AECⅡ增殖、分化和TGFβ1/Smad通路的影响及其机制,探讨Caveolae在肺泡上皮屏障的修复中的作用。方法:1.通过酶消化分离和免疫黏附法纯化,原代培养大鼠AECⅡ细胞,经碱性磷酸酶、肺泡表面活性蛋白-C(surfactant protein C, SP-C)荧光染色鉴定。2.将所培养的细胞按随机数字表法分为对照组、MβCD组。细胞计数、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期。3.免疫荧光双标和蛋白质印迹(western blot法)检测两组SP-C及水通道蛋白-5(aquaporin5, AQP-5)的表达。4.免疫荧光双标染色和非离子去污剂法提取脂筏,检测TGF-β受体Ⅰ(typeⅠtransforming growth factorβrecepter, TβR-Ⅰ)与小窝蛋白-1(Caveolin-1)在细胞膜上的分布;Western blot检测Caveolin-1和TGF-β1/Smad信号通路下游分子磷酸化Smad2(phosphorylated Smad2, p-Smad2)表达。结果:1.经碱性磷酸酶、SP-C荧光染色鉴定,原代培养AECⅡ细胞成功。2. MβCD组干预后细胞数目、增殖率与对照组相应时相点相比显著降低(P<0.05);MβCD组G0/G1期细胞比例较对照组显著增多,S期细胞比例较对照组显著减少(P<0.05),提示破坏Caveolae结构使AECⅡ细胞由G0/G1期向S期转化的百分比减少,细胞发生G0/G1期阻滞,显著抑制细胞增殖。3.对照组干预后48h同时表达AECⅠ的细胞标志物AQP-5和AECⅡ的细胞标志物SP-C,MβCD组仅表达SP-C;对照组干预后72h主要表达AQP-5,提示AECⅡ已转分化为AECⅠ,MβCD组主要表达SP-C,仍显示AECⅡ的表型,提示转分化受到抑制;与对照组相应时相点比较,MβCD组SP-C蛋白表达明显增多,AQP-5蛋白表达明显减少(P<0.05),提示破坏Caveolae结构可以显著抑制AECⅡ向AECⅠ转分化。4. TβR-Ⅰ主要分布于AECⅡ细胞膜上的Caveolae区域,MβCD破坏Caveolae结构后,TβR-Ⅰ重新分布于细胞膜上非脂筏区域。MβCD组与对照组相应时相点比较,Caveolin-1蛋白表达显著减少(P<0.05),TGF-β1/Smad信号通路下游分子p-Smad2蛋白表达较对照组增多(P<0.05),提示破坏Caveolae结构可以引起TβR-Ⅰ在非脂筏区域的聚集,减少TGF-β1的降解;此外,Caveolin-1蛋白表达减少,对TGF-β1/Smad通路的抑制减弱,导致TGF-β1/Smad通路激活。结论:1. Caveolae结构破坏后,AECⅡ细胞发生G0/G1期阻滞,显著抑制细胞增殖,提示Caveolae通过对细胞周期的影响,参与AECⅡ的细胞增殖。2.干预Caveolae结构可以显著抑制AECⅡ向AECⅠ转分化,提示Caveolae在AECⅡ转分化过程中起关键调控作用。3. Caveolae结构破坏可以引起TGF-β1/Smad通路激活,显著抑制AECⅡ的增殖和转分化,提示Caveolae结构的完整性可能是AECⅡ细胞增殖和分化的必要条件,Caveolae通过对AECⅡ增殖、分化的关键通路TGF-β1/Smad通路的影响,在肺泡上皮屏障修复过程中起调控作用。