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三阴性乳腺癌（TNBC）的治疗是当前乳腺癌关注的热点与难点,有研究报道免疫疗法对许多实体瘤具有很好的治疗效果。因此我们设计了一种水凝胶材料（a PD-L1+PLGA-GEM@Gel）,可以在伤口局部释放吉西他滨（GEM）和抗程序化死亡配体受体1（a PD-L1）。建立4T1细胞移植的小鼠肿瘤模型并进行肿瘤不完全切除术（TRS）,采用流式,TUNEL,Ki67和CD31等免疫组化的方法评估a PD-L1+PLGA-GEM@Gel联合放疗（RT）对TNBC术后复发和转移的作用。通过血常规、血生化和H&E的检测结果来评价a PD-L1+PLGA-GEM@Gel+RT对小鼠肝肾功能和器官毒性的影响。结果显示a PD-L1+PLGA-GEM@Gel+RT进一步降低了乳腺癌的大小、增殖、血管生成和肺转移且对小鼠肝脏和肾脏没有明显的毒副作用。上述结果说明:在乳腺癌术后治疗过程中,a PD-L1+PLGA-GEM@Gel+RT促进了荷瘤小鼠免疫介导的肿瘤消退且具有很好的抑制肿瘤复发和转移的作用,这提示包裹免疫治疗剂和GEM纳米制剂的凝胶在TNBC的治疗中可能具有良好的应用前景。目的建立TNBC的TRS模型,通过术后在伤口植入凝胶a PD-L1+PLGA-GEM@Gel,观察凝胶是否可以提高TNBC治疗效果以及能否抑制术后TNBC复发和转移,旨在为临床应用提供实验基础。方法（1）通过粒度分析仪、扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）对纳米颗粒PLGA-GEM的粒径、形貌等进行表征,采用高效液相色谱法（HPLC）测定PLGA-GEM的载药量与包封率以及药物的释放行为。体外培养鼠源4T1细胞,给予不同浓度梯度的GEM和PLGA-GEM药物剂量,检测PLGA-GEM对4T1细胞的细胞毒性。建立TNBC的TRS模型,通过TUNEL、Ki67和CD31免疫组化的方法来探讨PLGA-GEM抑制TNBC术后复发和转移的作用机制。（2）观察凝胶a PD-L1+PLGA-GEM@Gel在25°C和37°C条件下的状态,采用冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）和红外光谱对a PD-L1+PLGA-GEM@Gel进行进一步表征,并使用BCA蛋白定量试剂盒测定a PD-L1+PLGA-GEM@Gel的体外药物释放率。建立TNBC的TRS模型,通过流式细胞术检测小鼠脾脏相关免疫指标CD3、CD4和CD8的表达。采用免疫组化的方法来检测肿瘤组织相关蛋白的表达,包括γH2AX、TUNEL、Ki67、CD31以及通过小鼠器官（心肝脾肺肾）的H&E染色分析其病理特征,以此来探讨a PD-L1+PLGA-GEM@Gel抑制TNBC复发转移的免疫分子机制。同时检测血常规（包括红细胞、白细胞和血小板）和血生化（AST、ALT、CR、BUN）,评价a PD-L1+PLGA-GEM@Gel的生物毒性。结果1纳米颗粒PLGA-GEM对TNBC复发和转移的影响1.1 PLGA-GEM的表征纳米颗粒PLGA-GEM的粒径为223.50 nm,ζ电位为-25.40m V。SEM图像显示PLGA-GEM颗粒具有光滑的形态,TEM图像进一步显示PLGA-GEM颗粒为球形。其载药量和包封率分别为9.28%和63.7%,在0.05%Tween80（v/v）的PBS溶液中（0.02M,p H 6.0）,0.05%Tween80（v/v）的PBS溶液中（0.02 M,p H7.4）和37°C（0.01 M PBS（p H 7.4）+1%SDS:甲醇=60:40）混合溶液条件下,72 h后GEM释放率分别为0.22%,7.19%和6.99%。1.2不同浓度GEM和纳米颗粒PLGA-GEM的细胞毒性MTT的实验结果表明GEM和PLGA-GEM对4T1的细胞毒性具有浓度依赖性。GEM的IC 50值为0.1537,PLGA-GEM的IC 50值为29.44,相比较而言,GEM产生更高的细胞杀伤作用。1.3 PLGA-GEM抑制TNBC术后的复发和转移建立TNBC的TRS模型,通过移植瘤的生长曲线和瘤体大小,我们发现术后给予纳米颗粒PLGA-GEM的治疗能够抑制小鼠TNBC的生长。TUNEL免疫荧光染色结果显示TRS+PLGA-GEM组中阳性凋亡细胞数明显高于其余实验组,提示TRS+PLGA-GEM可以促进4T1乳腺癌细胞的凋亡。Ki67和CD31的染色结果说明TRS+PLGA-GEM可以抑制TNBC细胞的增殖和血管生成。另外,与单独的GEM治疗组相比,PLGA-GEM进一步抑制肺转移的发生。2凝胶a PD-L1+PLGA-GEM@Gel对TNBC复发和转移的影响2.1 a PD-L1+PLGA-GEM@Gel水凝胶的表征a PD-L1+PLGA-GEM@Gel在25°C时呈液体状态,而37°C条件下则凝固成固体状,Cryo-SEM下观察到a PD-L1+PLGA-GEM@Gel呈蓬松且疏松的多孔结构。对比空白水凝胶（Gel）和PLGA-GEM水凝胶（PLGA-GEM@Gel）的红外图谱可以发现,两者的红外特征峰基本一致。a PD-L1水凝胶（a PD-L1@Gel）和a PD-L1+PLGA-GEM水凝胶（a PD-L1+PLGA-GEM@Gel）在3300cm-1处出现了-NH2的伸缩振动峰,1620cm-1处出现了N-H弯曲振动峰以及990cm-1处出现C-N的弯曲振动峰都说明了a PD-L1负载于水凝胶中（抗体中含有大量氨基）。此外,在0.5%Tween 80的10 m L PBS（10 m M,p H6.0）和0.5%Tween 80的10 m L PBS（10 m M,p H 7.4）的溶液条件下,72 h后,a PD-L1+PLGA-GEM@Gel中a PD-L1释放率分别为50.08%和43.37%。2.2 a PD-L1+PLGA-GEM@Gel抑制TNBC术后的复发和转移对荷瘤小鼠进行TRS,我们发现水凝胶a PD-L1+PLGA-GEM@Gel联合RT能够抑制小鼠TNBC的生长。TUNEL免疫荧光染色显示a PD-L1+PLGA-GEM@Gel+RT可以促进4T1细胞的凋亡,Ki67和CD31的染色结果说明a PD-L1+PLGA-GEM@Gel+RT可以抑制4T1细胞的增殖和血管生成。此外,a PD-L1+PLGA-GEM@Gel+RT还产生了抑制远端肿瘤生长（肺转移）的全身抗免疫应答,并且通过血常规和血生化的检测结果发现使用a PD-L1+PLG A-GEM@Gel+RT治疗后的小鼠也未出现任何明显的毒性反应。结论研究首次揭示,术后将a PD-L1+PLGA-GEM@Gel注射入手术病灶,然后进行术后放疗可以在疾病部位进行集中治疗以打破局部的免疫耐受,从而在没有引起严重副作用的情况下产生全身性抗肿瘤免疫,增强化疗药物GEM对肿瘤细胞的敏感性,从而诱导乳腺癌细胞凋亡,这提示我们免疫联合放化疗法的多元化治疗策略可能为转移性TNBC的复发和转移的治疗提供平台。