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阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan-proteins,AGPs)是一类高度糖基化的糖蛋白分子,其氨基酸序列中富含脯氨酸/羟脯氨酸。AGPs广泛分布于植物各种组织和细胞中,属于富含经脯氨酸的糖蛋白(Hyp-riehglyeoproteins,HRGPs)家族。阿拉伯半乳糖蛋白参与了植物细胞的增殖、分化、细胞程序性死亡、植物细胞胚胎发生等活动。1.本文利用甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)作为实验的研究对象。选取了同样为十字花科的拟南芥中已经测定序列的两种AGP相关基因AtAGP3、AtAGP8,通过已有的文献及研究者已测出的序列合成基因,PCR产物先经SpeI/SacI双酶切,克隆至pTCK303载体,测序正确后再用BamHI/KpnI第二次双酶切克隆,以此来构建油菜的RNA干扰载体。同时以油菜种子萌发并准备工程感染菌株,将构建好的pTCK303-AtAGP3-1RNAi载体质粒、pTCK303-AtAGP3-2 RNAi 载体质粒、pTCK303-AtAGP3-3 RNAi 载体质粒、pTCK303-AtAGP8-1 RNAi 载体质粒、pTCK303-AtAGP8-2 RNAi 载体质粒、pTCK303-AtAGP8-3 RNAi载体质粒,分别转化农杆菌感受态EHA105后将其转化到油菜子叶柄中,并培养其愈伤组织至生根。2.本实验还研究了人工合成的βGlcY对拟南芥根生长发育的影响。将拟南芥种子分别于1/2 MS 培养基,1/2 MS+10 μM αG1cY培养基,1/2 MS+10μM βGlcY培养基,1/2 MS+10μM βGlcY>1/2MS培养基萌发培养。发现:(1)用βGlcY试剂处理拟南芥种子,随着种子萌发,βGlcY与拟南芥根表皮细胞壁的AGPs结合使根部呈现红色,与对照相比,βGlcY显著抑制了根的生长。随着根重新转入1/2 MS培养基上继续培养,使抑制得以恢复。进一步细胞学观察表明,AGPs与βGlcY相互作用导致根伸长区的细胞体积变小,表皮细胞产生明显的膨胀现象。(2)对照组拟南芥根的维管细胞部位能检测到大量PIN1的表达,且PIN1定位于细胞的形态学基部。而用βGlcY试剂处理过的拟南芥根部只能检测到极少量分布的PIN1蛋白,说明βGlcY阻碍了 PIN1蛋白的分布,从而影响了生长素向根部的极性运输。用βGlcY试剂处理4天后再转移到1/2 MS培养基上,检测到拟南芥根部的荧光亮度回升,表明PIN1蛋白的含量有所增加。(3)对照组拟南芥根部在根冠分生组织细胞中能检测到DR5蛋白的表达。但βGlcY试剂处理过后,拟南芥根冠分生组织细胞的DR5蛋白表达增强。用βGlcY试剂处理4天后再转移到1/2 MS培养基上培养4天,发现DR5在根冠分生组织部位的表达恢复正常。这些结果说明βGlcY处理拟南芥根后,导致生长素响应的蛋白过度聚集在根冠分生组织部位,抑制了根的生长。(4)PIN2定位于根的表皮细胞和皮层细胞的形态学顶端质膜上,说明生长素在PIN2蛋白作用下从根的基部经过表皮细胞向根的上方运输,并维持表皮细胞的生长和发育。但用βGlcY试剂处理后,根表皮细胞的PIN2蛋白表达减少或不表达,说明βGlcY与AGPs相互作用改变了 PIN2蛋白在细胞质膜上的极性定位,阻碍了生长素的极性回流,从而影响表皮细胞的模式形成,引起表皮细胞的发生膨胀。但重新转移到1/2MS培养基上培养后,这种阻碍是可逆的。