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轴周蛋白(Periaxin)是外周神经系统非致密性髓鞘中特异表达的一种蛋白,其占外周神经系统髓鞘蛋白的16%,对髓鞘形成的初始化有重要作用。但随着髓鞘的成熟,Periaxin在细胞中的定位逐渐变化,表达量也逐渐降低。L-periaxin是periaxin编码的一种蛋白亚型,其含PDZ(PSD-95/Dlg-/Zo-1 domain),核定位信号(Nuclear localization signal, NLS),重复区域(Repeat domain)和酸性区域(Acidic domain)四个结构域,其中PDZ结构域是可以识别并结合受体靶蛋白羧基末端的结构域。埃兹蛋白(Ezrin)是普遍存在的细胞-膜骨架蛋白,它可在多种细胞类型中表达。在有髓施万细胞的质膜上,包括Ezrin在内的ERM(Ezrin-Radixin-Moesin)蛋白家族的三个蛋白都可高水平表达。Ezrin蛋白包括FERM结构域,α螺旋结构域和C末端结构域三部分。Ezrin自身的氨基端与羧基端可以相互作用,形成自我抑制的构象,而567位苏氨酸(Thr,T)的磷酸化却可以解除该抑带。 L-periaxin与Ezrin除了能共同表达在施万细胞中外,二者在小鼠晶状体六角形纤维细胞中共同参与晶状体的成熟与装配。本文围绕L-periaxin与Ezrin蛋白之间的相互作用开展其互作模式的分析。首先通过免疫荧光共定位实验,检测了施万细胞RSC96株系中内源Periaxin与Ezrin的共定位情况,结果显示二者在细胞膜与细胞质中有明显的共定位现象。为了明确二者相互作用的具体区域,采用基因克隆技术,构建含Myc标签的L-periaxin蛋白的不同结构域以及含Flag标签的Ezrin蛋白的不同结构域的重组质粒。将不同截短型的蛋白分别瞬时转染进入施万细胞RSC96,免疫荧光法观察两蛋白不同结构域间的定位情况,结果揭示L-periaxin的N端区域(1-200aa)与C端区域(1060-1461aa)可以与内源Ezrin发生共定位,Ezrin的N端区域(1-296aa)与C端区域(475-585aa)可以与内源L-periaxin发生共定位；结合免疫共沉淀确定L-periaxin与Ezrin的相互作用方式为“头对头,尾对尾”。进一步又通过双分子荧光互补实验结合免疫共沉淀将L-periaxin与Ezrin的作用区域确定为L-periaxin的NLS结构域(104-200aa)和Ezrin的FERM结构域(1-296aa),L-periaxin的C末端区域(1368-1461aa)与Ezrin的C末端(475-585aa)。鉴于NLS区域存在三段序列分别为NLS1/NLS2/NLS3,针对NLS与Ezrin的FERM结构域作用的区域,利用荧光共定位与GST-pull down实验揭示L-periaxin的NLS3参与与Ezrin的FERM结构域相互作用。其次,通过对Ezrin567位Thr点突变为谷氨酸(Glu, E)或丙氨酸(Ala, A),分别模拟永久磷酸化与去磷酸化的状态,利用免疫荧光共定位观察到Ezrin 567位Thr模拟磷酸化后,Ezrin和L-periaxin可共定位在细胞膜上,而去磷酸化后则不可以,表明该位点的磷酸化可能能够引导Ezrin自身及L-periaxin定位细胞膜。但Thr的磷酸化对二者间的相互作用并没有明显的影响。最后,构建一对L-periaxin基因的TALENs载体,转染进入RSC96细胞,通过挑取单克隆,筛选出敲除L-periaxin基因的细胞株,其两个拷贝靶位点敲除的碱基数分别是23bp和10bp,可以造成L-periaxin蛋白出现移码突变,提前终止表达,从而获得敲除L-periaxin基因的稳定细胞系,为后续实验提供实验基础。