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甘蔗鞭黑粉菌(Ustilago scitaminea Syd.)是威胁甘蔗生产最严重的病原之一,具有腐生和寄生两个阶段。其单倍体菌体单胞,对甘蔗不具侵染性,并可在土壤中以芽殖方式不断增殖;当与相对性系不同的单倍体菌体有性配合后才产生对甘蔗生长点具侵染能力的双核菌丝。阻断其有性配合发生将可达到有效控制该菌侵染甘蔗之目的,为此,本研究以阻断该菌有性配合为目标,建立了生防细菌筛选体系,进而对所筛选的有效生防菌株荧光假单胞菌株YJHM58的作用机制进行了深入研究。主要研究结果如下:
1、于不同季节、不同环境中广泛采集不同基质,并进行细菌的分离培养,共获得了3900多个菌落性状不同的细菌菌株,采用建立的生防细菌筛选和有效活性物质测定体系,最终筛选获得对甘蔗鞭黑穗病菌有性配合表现出具有较高的抑制活性且对其单倍体菌体生长影响较小的有效菌株3个,均为革兰氏阴性细菌;初步试验显示其中菌株YJHM58产生的活性物质为蛋白类物质,BIOLOG系统鉴定和分子鉴定表明该菌株属于荧光假单胞(Pseudomonas fluorescens Migula)。
2、建立了适合生防细菌YJHM58菌株的Tn5转座子插入诱导突变体系,并通过对得到的3100多个Tn5插入突变体进行三轮定向筛选,获得了对甘蔗鞭黑粉菌有性配合完全失去抑制作用的功能突变体14个,多次转接和对峙试验表明其性状均十分稳定。
3、通过TAIL-PCR技术对其插入位点的侧翼序列进行了扩增,成功克隆了2个突变体的相关功能基因的部分序列,生物信息学分析结果表明,其中之一的基因对应的氨基酸序列与P.fluorescens PfO-1中编码的依赖ATP的蛋白酶Clp水解亚基(ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit)有100％的同源性。另一个基因对应的氨基酸序列则与P.fluorescens PfO-1菌株中编码的喹啉tRNA核糖转移酶(queuine tRNA-ribosyltransferase)有95％的同源性。它们可能与细菌蛋白质的转运以及分解代谢过程相关。
4、选择因Tn5插入导致功能突变的菌株1697(1697::Tn5)进行功能互补分析。该突变株因其编码丝氨酸蛋白酶水解亚基的相关基因clp被突变,而引致抑制黑粉菌有性配合活性功能丧失。利用P.fluorescens PfO-1菌株的全基因组序列,设计了针对目的基因clp的两对引物进行扩增,其中一对引物的扩增片段携带自身启动子序列,另一对引物则不扩增该序列。经双酶切后的扩增片段和质粒pLAFR3在T4 DNA连接酶作用下,通过连接构建了功能互补载体,其转化子即为互补供体菌Escherichiacoli[pLAFR3-clp],在质粒pRK2013的协助下,通过三亲结合对受体菌1697::Tn5进行了功能互补。结果表明只有携带有基因clp自身启动子序列的插入片段才能互补成功,互补转化子对甘蔗鞭黑粉菌的有性配合表现与野生型细菌菌株YJHM58相同的抑制作用。从而证实了由于该基因的插入失活而导致了该生防菌抑制配合活性的丧失。
5、为了进一步明确该基因在野生型荧光假单胞菌YJHM58抑制配合的作用机制,对该基因进行了原核表达分析和抑制配合活性测定。以pET32a(+)作为原核表达载体,在获得目的基因咖的完整阅读框后,经双酶切和T4 DNA连接酶作用下进行连接,构建了重组表达载体pET32a(+)-clp,双酶切以及测序证明其连接方向和阅读框完全正确。选择大肠杆菌E coli BL21(DE3)做为表达宿主细胞,对重组表达载体pET32aq[+)-clp的融合蛋白的表达进行了分析。SDS-PAGE结果表明,重组表达载体转化子的融合蛋白在IPTG低温诱导下得到了大量的表达,且该融合蛋白的表达量在一定时间内呈逐渐递增的趋势,这表明由质粒载体pET32a(+)构建的重组表达载体和大肠杆菌E coli BL21(DE3)均非常适合该融合蛋白的表达。同时,还比较了IPTG和温度对其菌体胞外蛋白表达的差异性。SDS-PAGE结果表明,在低浓度IPTG和28℃的低温诱导下,其胞外蛋白的表达分泌量多于37℃高温无诱导剂时的蛋白表达量。同时也表明低浓度的IPTG和28℃的低温培养条件是其融合蛋白诱导产生和向胞外分泌表达的二个重要因素。最后,以抑制甘蔗鞭黑粉菌两个单性系的有性配合作为其活性的生测靶标,结果表明在IPTG低温诱导下,重组表达转化子诱导表达的融合蛋白和分泌的胞外蛋白以及菌株培养滤液均表现出一定程度上与野生型菌株相类似的活性,而在高温和无诱导剂条件下其胞外蛋白则不表现抑菌活性,但菌体具有较强的抑制活性。