论文部分内容阅读
Toll样受体家族(Toll-liker receptors，TLRs)在固有免疫系统中发挥着举足轻重的作用，Toll样受体4(TLR4)是其最重要的成员之一。哺乳动物的TLR4能识别脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、呼吸道合胞体病毒(respiratory syncytial virus，RSV)和小鼠乳房肿瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)的包膜蛋白。与哺乳动物不同，鱼类tlr4基因仅在鲤科鱼类中有报道，并且斑马鱼的tlr4基因以基因簇的形式存在。近期的研究表明，斑马鱼的tlr4基因是人TLR4基因的旁系同源基因，而且斑马鱼Tlr4s不识别LPS。由草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)引起的草鱼出血病是对草鱼危害最大的传染性疾病之一。为了发掘GCRV抗性相关基因，本研究对草鱼4个tlr4基因做了初步研究，具体分为以下几个部分：
通过菌落原位杂交筛选得到3个阳性BAC克隆，Southern印迹表明这3个克隆中都含有4个tlr4基因。采用亚克隆的方式得到了4个基因的基因组序列。跨亚克隆PCR结果表明，它们以相同的方向紧密排列在基因簇中。
用RACE-PCR的方法扩增得到了4个tlr4基因的全长cDNA序列。预测的草鱼Tlr4s的氨基酸序列与其他物种的TLR4s有很高的相似度。其中，CiTlr4.2、CiTlr4.3、CiTlr4.4是典型的TLRs，而CiTlr4.1只有亮氨酸富集结构域，而没有跨膜区和TIR结构域(Toll/IL-1 receptor domain)，是迄今在鱼类中发现的第一个可溶性的Tlr4蛋白。
RT-PCR技术检测了草鱼tlr4基因的转录表达情况。Citlr4.1，Citlr4.2，Citlr4.3，Citlr4.4都广泛表达于血液、鳃丝、脑、肝脏、脾脏、后肠、中肾、头肾、心脏、肌肉中。草鱼胚胎在受精12小时后，就能检测到这4个基因的表达。GCRV感染后，4个基因在肝脏和肌肉中都有明显的上调趋势。