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原发性胆囊癌(Gallbladder carcinoma,GBC)是最常见的胆道系统恶性肿瘤,居消化系统肿瘤第五位。因胆囊癌的早期发现和诊断困难,多数胆囊癌患者就诊时已是晚期,目前胆囊癌5年生存率仅5%～10%,肝和淋巴结是胆囊癌主要的转移途径,而且淋巴结转移在早期就可出现,提示预后很差。因此,探索胆囊癌淋巴转移的机制,研究针对肿瘤淋巴转移过程的有效治疗方法,显得尤为重要。新近研究表明VEGF-C和VEGF-D通过与其受体血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factorreceptor-3,VEGFR-3)结合,诱导肿瘤淋巴管生成,促进肿瘤淋巴结转移。本研究通过慢病毒介导siRNA干扰VEGF-D基因表达,观察对人胆囊癌细胞体外增殖、侵袭及裸鼠体内皮下以及原位接种移植瘤生长和淋巴转移的影响。1. siRNA干扰VEGF-D的表达对人胆囊癌细胞增殖、侵袭的影响1)高表达VEGF-D胆囊癌细胞株筛选:通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western-blot)的方法探讨VEGF-D在胆囊癌细胞株(GBC-SD、SGC-996、NOZ)中的表达情况,筛选出在蛋白水平高表达VEGF-D的胆囊癌细胞株NOZ。2)VEGF-D有效siRNA序列的筛选:按照siRNA序列设计原则设计并合成4条针对VEGF-D基因的siRNA,脂质体转染胆囊癌细胞NOZ,RT-PCR检测转染特异siRNA后胆囊癌细胞VEGF-D mRNA的表达情况,挑选最有效抑制VEGF-D基因表达的一条干扰序列(GCTATGGGATAGCAACAAATG)进入后续实验。3)VEGF-D siRNA慢病毒载体的构建:双酶切pGCSIL-RFP慢病毒载体后构建穿梭质粒,再与骨架质粒共转染293细胞,同源重组,酶切鉴定,包装扩增后得到重组慢病毒VEGF-D-RNAi-LV,孔稀释法测定Lentivirus病毒滴度为2E+9TU/ml,VEGF-D-RNAi-LV感染人胆囊癌细胞NOZ,CON-RNAi-LV感染人胆囊癌细胞NOZ作为对照。荧光显微镜下计算慢病毒感染效率约为80%,采用RT-PCR和Western-blot分别从mRNA和蛋白质水平检测其对VEGF-D表达的抑制率达62.09%和76.72%。4)siRNA干扰VEGF-D对人胆囊癌细胞体外增殖、侵袭的影响:MTT法测定感染VEGF-D-RNAi-LV和CON-RNAi-LV后胆囊癌细胞NOZ体外增殖,酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值,与空白对照组相比,VEGF-D-RNAi-LV感染组细胞的存活率降低41.3%,差异具有显著性(P<0.05),利用侵蚀小室(Transwell-Matrigel)实验检测感染VEGF-D-RNAi-LV和CON-RNAi-LV后胆囊癌细胞体外侵袭能力,干扰组细胞穿膜细胞数为(35.6±4.0),而空白对照组细胞穿膜细胞数为(46.8±5.3),阴性对照组细胞穿膜细胞数为(44.8±3.9)。干扰组和空白对照组差别有统计学意义(P=0.006,P<0.01)。体外实验证实siRNA干扰VEGF-D具有抑制人胆囊癌细胞体外增殖、侵袭的作用。2. siRNA干扰VEGF-D的表达对人胆囊癌细胞裸鼠移植瘤淋巴生成和淋巴转移的影响1)裸鼠皮下胆囊癌:15只裸鼠,随机分为3组,每组5只,分别将对数生长期NOZ细胞,阴性对照细胞株NOZ/shCTRL和VEGF-D稳定干扰细胞株NOZ/shVEGF-D,注入实验裸鼠左前腋皮下,观察4w,成瘤率为100%,解剖腋下、腹股沟淋巴结及肝肺,免疫组化检测VEGF-D的表达及微血管及微淋巴管密度。结果:3组动物均未发现局部淋巴结及肝肺转移。siRNA可抑制胆囊癌细胞NOZ皮下移植瘤VEGF-D的蛋白表达。VEGF-D的基因沉默可显著减少皮下移植肿瘤的生长,干扰组肿瘤体积是(571.0±126.7)mm3、阴性对照组肿瘤体积为(1909.8±896.1)mm3、空白对照组肿瘤体积为(2229.6±942.5) mm3,干扰组与阴性对照组和空白对照组比较差异有统计学意义(P<O.01);干扰组肿瘤重(1.560±0.249)g明显低于阴性对照组(2.694±0.348)g和空白对照组(2.488±0.332)g (P<O.01)。VEGF-D的基因沉默可显著减少皮下移植肿瘤微淋巴管增生,干扰组微淋巴管密度为(12.0+2.00),阴性对照组和空白对照组分别为(20.6±2.507)和(20.2±1.732)。干扰组淋巴管密度显著小于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。VEGF-D的基因沉默对皮下移植瘤的微血管增生没有影响。2)裸鼠原位胆囊癌:15只裸鼠,随机分为3组,每组5只,分别将对数生长期NOZ细胞,阴性对照细胞株NOZ/shCTRL和VEGF-D稳定干扰细胞株NOZ/shVEGF-D混悬于50%的基质胶内,以微量加样器抽吸胆囊癌细胞悬液,直接穿刺注射胆囊内,4w后成瘤率为93.33%,解剖裸鼠,免疫组化检测VEGF-D的表达及微血管及微淋巴管密度,观察干扰VEGF-D对肿瘤微血管和微淋巴管生成的影响。结果:siRNA可抑制胆囊癌细胞NOZ原位移植瘤VEGF-D的蛋白表达。阴性对照组4只出现血性腹水,干扰组没有发现血性腹水(P<0.05)。阴性对照组和空白对照组裸鼠均出现肉眼可见的肝内转移,而干扰组没有发现肝内转移(P<0.05),3组动物均未见肺转移。VEGF-D的基因沉默可显著减少原位接种胆囊癌淋巴增生,测LVD干扰组为(14.76±2.13),明显低于阴性对照组(49.10±3.00)和空白对照组(51.48±3.83) (P< O.01)。而且干扰组淋巴管变扁平甚至成条索状。而对原位移植瘤的微血管增生没有影响。结论:1)慢病毒RNAi表达载体可有效地抑制胆囊癌细胞中的VECF-D基因表达。2)siRNA干扰VEGF-D具有抑制人胆囊癌细胞体外增殖、侵袭的作用。3)VEGF-D的基因沉默可显著减少胆囊癌皮下移植瘤的生长。4)VEGF-D的基因沉默可显著减少原位接种胆囊癌淋巴增生、淋巴转移和肝内转移,而对皮下和原位移植瘤的微血管增生没有影响。