论文部分内容阅读
由于石油、天然气和煤炭等不可再生能源的常年开采而逐渐面临资源枯竭,全球正遭遇着越来越严重的能源危机。我国地域广阔、人口众多,资源丰富,但人均资源则相对匮乏,随着我国经济的高速发展,对能源需求量巨大,能源危机更为突出。因此,探索可再生、可持续、无污染、高效清洁的新能源已成为我国乃至全球科学家重点研究的目标之一。生物乙醇作为唯一一种能以液态形式存在的新能源,是我国现阶段最有可能实现产业化生产的主要生物能源产品之一,也是我国生物能源产业发展的重点。以粮食和油料作物为原料来生产乙醇可能会威胁国家粮油食品安全,而植物纤维素则是一种非常有潜力、前景广阔的生物乙醇的生产原料。我国有大量的盐碱地、荒地、次生退化土壤,因此结合我国国情,充分利用好这些宜耕边际性土地,筛选、培育适应性好、抗逆性强、具有较高生物量的能源作物高粱等,为生物乙醇生产提供大量优质原料具有重要意义。高梁具有C4植物的高光合效率,抗逆性强,生长期短,适应性广。即使在贫瘠、盐碱、干旱土地上种植也有较高产量和生物量。此外高粱基因组较小,有丰富的种质资源和生物信息学资源,又有大量EMS诱发的突变体,因此有必要选择出其中的耐盐碱种类进行深入研究、分析,培育出能在盐碱地、旱地正常生长发育的能源高粱新品系,对大量黄/褐中脉突变体的研究,有利于从分子机理上了解木质素代谢的调控,为进一步通过基因工程改良能源高粱创造条件。植物通过光合作用将绝大部分有机物转化为细胞壁成分,其主要成分为纤维素、半纤维素、木质素。木质素的水解产物影响纤维素酶对纤维素的水解效率,使纤维素转化为乙醇的成本提高。因此有必要系统认识高粱木质素合成及其基因表达调控的分子机制,分离木质素合成调控的关键基因。多种作物黄／褐色中脉(bmr)突变体的木质素含量明显降低,是研究木质素合成及调控的良好试验材料。但是至今为止,仅对少数bmr突变体与木质素合成的关系有所了解,大多数的突变体还有待于进一步研究。为了寻找耐盐碱的高粱品种,本论文对美国农业部收集的高梁种质资源进行筛选,获得抗盐碱种质材料,为在盐碱地发展能源植物提供了有用的实验材料；本论文同时通过抑制性差减(SSH)技术分别构建13种bmr突变体混合体与BTx623野生型对照的正、反向差减文库；从正反向文库中挑选cDNA片段制作基因芯片,分析其表达模式；根据基因的表达模式,从中筛选与木质素合成及调控相关的EST片段,并进一步克隆了部分差异表达基因；初步鉴定了这些基因的功能,为高粱及其它能源植物细胞壁成分的改良,培育低木质素的新种类提供了有益的线索。具体研究内容及结果包括：1.高粱耐盐性种质资源筛选根据美国农业部植物研究服务署(USDA-ARS)种植资源系统(National Plant Germplasm System)所收集管理的高粱信息,我们在其收集的1200多份甜高粱中选取锤度大于10,蔗糖含量高于4的甜高粱717份,及四万多份粒用高粱中高度大于2,5米,整齐度小于2.5的粒用高粱4222份,重新编号,进行大规模、高强度(150-200mmol/L NaCl)、长时间(25-40天)的耐盐性筛选。通过对甜高粱的两轮耐盐性筛选,共得到了耐盐株系83个,移栽成活65个株系,其中46个株系收到种子；对普通高粱进行耐盐碱筛选,并移种大田或花盆312个株系,大多数完成生活周期并获得了种子。在东营盐碱地中播种了31种筛选得到的耐盐甜高粱,结果表明碱地中甜高粱的出苗率略高于盐碱地。但其总生物量差异不大,盐碱地单株平均重量比碱地高。多数甜高粱在盐碱地中的锤度高于碱地。不同甜高粱的单株种子产量在盐碱地和碱地差异很大。盐碱地生长的甜高粱比同时播种在碱地的甜高粱提早成熟5-7天。2.利用SSH和cDNA芯片技术分析bmr突变体和野生型高粱BTx623的表达差异为了研究高粱bmr突变体细胞壁合成代谢及调控机制,我们用抑制性差减(SSH)文库和cDNA芯片联用的方式检验了bmr突变体和野生型高粱BTx623的差异表达基因。共得到153个差异表达基因,其中43个在bmr突变体中上调表达,110个基因在bmr突变体中表达受抑制。我们对其中12个差异表达基因进行半定量RT-PCR验证,结果证明了基因芯片数据是正确的。差异表达基因根据功能不同可分为11类：代谢、光合作用、遗传信息的加工、胁迫响应、蛋白命运、信号转导、转运、木质素合成、细胞过程和移动性、发育和调节及其它,其中代谢类的差异表达基因数量最多。光合作用类别的17个差异表达基因中,16个在bmr突变体中的表达都受到抑制,这一点和部分bmr突变体生物量减少的表型相一致。结果,我们从高粱bmr突变体中找到了一批差异表达基因,其中的CYP基因在bmr突变体中表达下调,这与bmr突变体中木质素含量降低一致；而木质素合成的苯基丙烷途径中的一个C4H基因,在bmr突变体中表达上调,该结果可能预示高粱的三个C4H在合成细胞壁的过程中,其功能有所分化；MYB.NAC.Lim等转录因子的表达在bmr突变体和野生型中没有明显的差异,但却发现bHLH转录因子在多个bmr突变体中明显上调表达。本文进一步对这3个基因进行了结构、表达分析及功能的初步鉴定。3.高粱木质素合成代谢相关基因的功能鉴定SbHLH的功能研究SbHLH是13种bmr突变株系与野生型SSH筛选和芯片杂交后得到的表达上调最高的一个转录因子,该基因信号在芯片杂交结果中重复出现达6次之多,表明其可能是多种bmr变体共有的一个调节信号。RT-PCR结果表明,7个bmr变体的叶片在7叶期该基因的表达也明显上调。SbHLh在根、茎、叶中有不同的转录活性,在叶中表达量最高,茎中的表达量最低,这与该器官的木质化程度有密切关系。在酵母菌中,全长SbHLH具有转录激活活性,表明它是一个转录因子；缺失N端低复杂性区时,即使HLH结构域完整存在也没有转录活性,说明该低复杂性区对HLH结构域及转录激活功能的重要性；C端缺失不能影响其转录激活能力。通过该蛋白偶联GFP,基因枪法转化洋葱表皮,结果表明该基因表达产物定位在细胞核。在拟南芥中过表达SbHLH后,转基因拟南芥的表型在幼苗期没有明显变化,也能正常完成的生长周期,但在后期由于茎伸长,过表达系比野生型容易发生倒伏。6周龄的冰冻切片染色结果及木质素含量测定表明,过表达拟南芥茎的木质素含量比野生型和空载体对照明显降低,木质素合成途径和类黄酮/花青素合成途径中部分相关基因的表达受到不同程度的抑制,如]DAL1,4CL,CCR1, HCT, COMT, CHI, UGT等基因。因此,SbHLH很可能是苯基丙烷代谢途径的转录抑制因子。SbCYP功能研究SbCYP基因在多个bmr突变体的7叶期中均呈现下调表达的趋势；与之相反,该基因在野生型高粱(BTx623)的5叶期到7叶期的表达呈上调趋势。在拟南芥中过表达SbCYP后,转基因拟南芥能完成正常的生长发育周期但在6周龄时的茎中,木质素含量和野生型拟南芥没有明显差异,不过在8周龄过表达的拟南芥株系茎中,木质素含量则明显升高；同时部分木质素合成相关基因(PAL1,4CL1, CCoAOMT, CCR1等基因)也被诱导表达,这些结果说明SbCYP参与了木质素的合成或调控。SbCYP的调控模式在bmr突变体与野生型高粱中明显不同,这可能是造成bmr突变体木质素含量降低的原因之一,也可能是受到其它上游基因(例如SbHLH)调控后出现的效应。SbC4H功能研究SbC4H基因在多个bmr突变体中都呈现出上调表达的趋势。将SbC4H生拟南芥中过表达后,在6周龄的转基因拟南芥,其茎中的木质素的含量较野生型明显降低,同时SbC4H过表达拟南芥中的部分木质素合成相关基因(例如4CL1,4CL, F5H1)的表达受到一定的抑制。总之,通过对高粱bmr突变体和野生型高粱中的差异表达基因SbHLH, SbCYP和SbC4H在木质素合成中的功能研究,发现他们在木质素合成及调控中起着重要作用,实验结果丰富了我们对bmr突变体以及木质素合成调控的认识,也为进一步的能源作物的细胞壁改良提供了理论基础和候选基因。