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假单胞菌株M18(Pseudomonassp.M18)与已报道所有假单胞菌属菌株不同,可以同时合成并分泌两类抗生物质。一类是吩嗪(Phenazine),另一类是藤黄绿菌素(Pyoluteorin,Plt)。吩嗪类物质主要成分是吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylicacid,PCA)。这两类抗生物质可以抑制或杀灭引起作物病害的多种真菌等病原微生物。因此,该菌株在现代农业中有广阔的应用前景。
为了阐明假单胞菌株M18的抗生物质合成的调控路径、调控机制以及构建绿色农业生产上高效的生防菌株,减少并最终替代化学农药的使用,分别从该菌株的基因组DNA中克隆了gacA、rsmA和rpoS等与两种抗生物质合成密切相关的调控基因及它们的相邻序列。同源性分析结果显示,这些调控基因与大肠杆菌及其它革兰氏阴性菌的相应基因基因一般有60-90﹪的同源性。其中与铜绿假单胞菌PAO1(P.aeruginosaPAO1)的同源性最高,达到99﹪。
利用同源重组技术,分别构建了上述调控基因gacA、rsmA和rpoS的抗性基因定点插入突变株M18G、M18R和M18S。在PPM和KingsB(KMB)两种培养基发酵液中,提取并用高效液相色谱(HPLC)定量检测突变菌株和野生菌株合成的抗生物质。
检测结果显示,gacA基因突变株M18G与野生菌株M18相比,其PCA的合成与分泌量显著提高,尤其在KMB培养基中与野生型相比提高达30倍。而不论在PPM还是在KMB培养基中,突变株M18G的Plt的合成则被完全抑制。表明与其它假单胞菌株GacA对抗生物质的正调控作用不同,假单胞菌株M18的GacA对两种抗生物质合成代谢具有明显的区别性调控,即对抗生物质PCA的合成具有抑制作用(负调控机制),对抗生物质Plt的合成具有促进作用(正调控机制)。
rsmA基因突变株M18R发酵结果显示,在上述两种培养基中抗生物质PCA的合成量比野生菌株显著减少,而抗生物质Plt的合成量与野生菌株相比有大幅度的提高。表明,假单胞菌株M18全局调控因子RsmA对抗生物质合成代谢同样具有差异性调控。其中RsmA对抗生物质Plt合成具有负调控作用,对抗生物质PCA合成具有正调控作用。
对假单胞菌株M18的rpoS基因突变株M18S的发酵分析表明,作为静止期表达的转录调节因子(σ38)对抗生物质的合成代谢有显著的影响。rpoS基因的插入失活使抗生物质PCA的合成显著减少,但抗生物质Plt的合成量显著增加。由此推测,假单胞菌株M18的RpoS因子对PCA的合成具有正调控作用,对Plt的合成具有负调控作用。
对基因的反式互补实验和β-半乳糖苷酶基因的翻译融合表达载体的构建与分析,进一步证明了上述结果。
为了进一步确定全局调控因子GacA调控发生作用的可能水平,以gacA基因突变株M18G为出发菌株构建了rsmA基因的抗庆大霉素基因插入的双基因突变株M18GR。双突变株的PCA和Plt合成量的变化分析表明,调控因子GacA很可能在转录后水平上调控PCA和Plt等抗生物质的合成。
根据PCA和Plt合成基因簇的序列结构,分别设计了可以扩增250bp的phzD、pltC基因片段的两对引物。以野生型菌株M18和其衍生株M18G、M18R等的总RNA为模板进行一步法RT-PCR。该结果表明,GacA和RsmA在转录后水平上调控PCA和Plt等抗生物质的合成。
为了阐明上述相关基因对抗生物质PCA和Plt的调控通路和机制,在上述研究基础上,进一步通过构建调控基因与β-半乳糖苷酶基因的翻译融合表达载体(-lacZ)和相关融合突变株(-lacZ)来鉴定调控基因间的相互作用和相互影响。结果表明,在假单胞菌株M18中,其中GacA对RsmA、RpoS的表达没有影响,但RsmA对RpoS的表达有明显的正调控作用。推测RsmA可能通过降解尚未被分离或鉴定的RpoS转录或翻译的阻遏因子,从而正调控RpoS的表达。由此,首次提出并建立一条假单胞菌株M18抗生物质合成代谢的可能调控通路,即RsmA正调控RpoS表达,再通过RpoS区别性调控上述两种抗生物质的合成代谢。
在研究上述两种抗生物质的代谢相关性过程中,发现Plt的合成缺失对PCA的合成没有影响,但PCA的合成减少却增加了Plt的表达。过量的PCA可以影响并部分抑制plt基因簇的表达。在假单胞菌M18中,Plt也表现出自调控的机制。