论文部分内容阅读
目的探讨兔枕大池二次注血法建立SAH后CVS的模型、ERK1/2和PCNA在兔SAH后脑血管壁的动态表达及血管壁细胞病理性增殖过程材料和方法1、实验材料日本健康大耳白兔40只,(中国医科大学动物实验中心提供),雌雄不限,实验动物单笼喂养,标准饲料喂养2周后再行枕大池注血。2、实验方法(1)动物分组将40只大耳白兔随机分成5大组:①对照组(8只):在一次枕大池注血前处死取材;②.SAH 3天组(8只):在一次枕大池注血后48h或二次注血后1h处死取材;③SAH 7天组(8只):在一次枕大池注血后第7天处死取材;④SAH 14天组(8只):在一次枕大池注血后第14天处死取材。其中每组里3只兔用来做光、电镜形态学观察,每组剩下的5只兔用Western蛋白印迹法检测T-ERK1/2、p-ERK1/2和PCNA的表达情况。⑤DSA组(8只):分别于一次枕大池注血前(Day1)和一次注血后第7天(Day 7)行选择性脑血管数字减影检查。(2)动物模型建立选择体重2.5-3.0kg,兔龄6-9个月健康大耳白兔,用10%水合氯醛腹腔麻醉(3-5ml/kg),检验兔呼吸及心率,将兔固定于操作台上,枕项部剃毛,常规消毒,于枕部中线作一直切口,长2.5cm,用5号头皮针穿刺枕大池,按照0.5ml/kg放出脑脊液后,立即从兔耳中央动脉按照1ml/kg抽取动脉血注入枕大池中,一般1min左右,防止注射过慢血液凝固,立即将兔头低位30°,持续15min。第一次枕大池注血定义为实验第一天(SAH 1d),依此类推,在首次注血48h后(SAH 3d),以同样的方法行第二次枕大池注血,制作兔SAH模型。(3)动物的观察观察对照组、SAH各组及DSA组动物的饮食情况、活动情况及神经功能变化等,并记录SAH 14天组每只兔每天的具体情况、对动物予以评分。(4)数字减影(DSA)脑血管造影观察造影组8只兔每只兔分别于一次枕大池注血前(Day 1)和一次注血后第7天(Day 7)行两次脑血管数字减影检查。(5)兔基底动脉标本的获取各实验组分别在各个对应时间点采用“心脏灌流固定法”处死动物并取材。(6)基底动脉的光镜观察10%甲醛固定,酒精梯度脱水,石蜡包埋切片,常规HE染色。(7)基底动脉的电镜观察将基底动脉标本浸泡于2.5%戊二醛中预固定24小时,1%四氧化饿再固定,丙酮逐级脱水,EponslZ包埋,半薄切片光学定位,超薄切片醋酸铀及构椽酸铅双重染色,超薄切片用JEM-1200EX型透射电镜观察,拍片。(8)Western blot检测基底动脉PCNA、p-ERK1/2及T-ERK1/2蛋白的表达应用Western blot检测PCNA、p-ERK1/2及T-ERK1/2蛋白的动态表达。3、统计学方法数据用(?)+(?)表示,应用SPSS 13.0 for Windows软件进行数据统计,P＜0.05时,差异有显著性意义。实验结果1、选择性脑血管数字减影(DSA)组检测兔基底动脉直径的痉挛情况与对照组相比,SAH后7天基底动脉直径显著缩小(P＜0.05),有统计学意义。2、SAH 14天组每只兔每天的饮食、活动及神经功能评分情况各只兔在SAH后3天临床症状加重,7天时达到顶峰,而后逐渐好转,14天时恢复正常。3、病理形态学观察结果(1)大体标本观察SAH Day 3组和Day 7组实验动物开颅取材,蛛网膜下腔可见血性CSF,脑底部、脑池内,尤其是基底动脉周围存在大小不等暗红色血凝块,周围蛛网膜稍粘连,对照组和SAH Day14组则无异常表现。(2)光镜和电镜观察结果光、电镜观察到基底动脉壁在SAH后3天、7天发生了显著的病理性增殖改变,而SAH后14天无明显病理改变4、Western blot检测基底动脉PCNA、p-ERK1/2及T-ERK1/2蛋白的表达T-ERK1/2无显著性差异,而p-ERK1/2、PCNA的表达在SAH后3天显著增高并在7天时达到高峰,而后逐渐降低,14天时降到无显著性差异结论1、采用枕大池二次注血法建立日本大耳白兔SAH后CVS模型是稳定可靠的,并能很好的模拟人类SAH后CVS。2、SAH后CVS并非单纯的功能性的血管平滑肌收缩,同时伴有血管壁的器质性病理性增殖改变。3、磷酸化ERK1/2可能参与了SAH后脑血管痉挛动脉的病理性增殖的发生、发展过程。