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意义和目的 牛乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，尤其是其钙含量高且钙磷比例适当，易被人体消化吸收，还含有免疫球蛋白等抗病因子，因此牛乳及乳制品是人类改善营养、增强体质不可缺少的理想食品。我国已于2000年11月15日正式启动“学生饮用奶计划”，旨在提高全民营养状况、推动我国农业经济发展。目前世界人均牛乳年消费量为94kg，亚洲人均40kg，而我国仅为7kg，相差甚远，除了经济发展水平以外，一个重要的原因就是在中国人群中有很大一部分患有乳糖不耐受症。乳糖是牛乳中主要糖成分，其含量约为5％左右。许多人(因人种而异，西欧占2-8％，亚洲、非洲占60-90％)体内缺乏乳糖酶，因此他们很难消化牛奶，饮用牛奶后，乳糖在肠道内，被肠道细菌分解发酵，产生大量二氧化碳气体，导致肠道膨胀，并兴奋肠道蠕动，使收缩加强，造成肠鸣和腹泻，这种疾病称为乳糖不耐受症。生产低乳糖乳及乳制品是解决乳糖不耐受症问题的最佳途径。 β-半乳糖苷酶(β-D半乳糖苷半乳糖水解酶，β-D-galactoside galatohydrolase,EC 3.2.1.23)通常被称为乳糖酶(Lactase)。该酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的转移作用。乳糖酶广泛存在于植物、细菌、真菌、放线菌以及动物肠道中。乳糖酶主要用来治疗乳糖不耐受症，处理加工牛乳、乳清，生产低乳糖牛奶和乳制品。近几年随着人们对乳糖不耐受症认识的深入，乳糖酶在食品和乳制品工业中的作用日益显著。但目前乳糖酶并未在中国食品和乳制品工业中得到广泛应用，主要原因是：(1)乳糖酶的单位产量较低；(2)市场上销售的乳糖酶多为胞内酶，酶的耐热性差、适用范围窄；且这种酵母来源(Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis)的胞内酶，需破碎细胞才能得到，提取、纯化工艺繁杂。由于上述等原因致使乳糖酶销售价格过高、应用成本昂贵、适用范围窄，不能满足食品和乳制品工业多方面的需要。 本论文研究的目的是从本实验室保存的一株产乳糖酶的亮白曲霉(Aspetgillus candidus)中克隆并获得拥有自主知识产权的乳糖酶基因，构建高效表达、有效分泌乳糖酶的重组毕赤酵母生物反应器，以解决乳糖酶单位产量低、胞内酶提取困难的问题。期望利用生物技术开发一条乳糖酶高效生产的新途径。 中国农业科学院博士学住论文结论 1．本研究从一株产乳糖酶的亮白曲霉（ASpergillu candidus冲克隆得到了乳糖酶基因组DNA及CDN＊序列，序列分析表明，该乳糖酶基因组DNA序列长3458hp，其中含有8个内含子，CDNA编码区长3015hp，共编码1005个氨基酸，前19个氨基酸为信号肽序列，氨基酸序列中共含有11个潜在的糖基化位点。将不同来源的乳糖酶基因与此基因进行比较发现，该基因与绝大多数乳糖酶基因同源性较低；与商业化应用的、在本研究中作为对照的 A．o叭ae ATCC 20423的乳糖酶基因组 DNA和衍生的氨基酸序列比较，两基因CDNA的同源性为99％，氨基酸的同源性为99．5％，二者的基因组DNA序列中有19个碱基不同，内含子区域有5个碱基不同，CDNA序列中有 14个碱基不同，其中 3个碱基的变化引起了 3个氨基酸的改变：ZI＋，T从cry a幻一？U．can＆血小 牡0，1U．口W二a一～＊U．can”山小989，NU．O炒二ae—D（．candidusX但经实验证实，二者在酶学性质上有显著的差异，由此说明我们克隆到了一个新基因，我们己将该基因在 GENEBANK中登录，登录号为：EMBLACCESSIONNO．AJ431643。 2．研究了亮白曲霉的乳糖酶的酶学性质：其最适叫．2，最适温度为60OC，PH稳定范围在pH3习之间，比活为706．54U／mg，以ONPG为底物时的义为1石7mmol几，七x为3．33卜mo厂L。将亮白曲霉的乳糖酶与商业化应用的、本研究作为对照的米曲霉ATCC 20423的乳糖酶进行了酶学性质的比较，结果表明亮白曲霉的乳糖酶在热稳定性、金属离子稳定性、比活、（、pH范围方面均优于后者，该乳糖酶具有更优越的酶学性质，在工业化生产中具有更广阔的应用前景。 3．亮白曲霉的乳糖酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中均得到了表达，大肠杆菌表达的乳糖酶蛋白分子量约为 11 okD，与理论分子量山 okD湘符；毕赤酵母表达的乳糖酶蛋白分子量为120．130kD，二者分子量之间有差别的原因可能是毕赤酵母表达系统可对该蛋白进行翻译后的糖基化修饰作用，而原核表达系统不具备该功能。 毕赤酵母表达系统可高效地表达有生物活性的亮白曲霉的乳糖酶，分泌表达量近 6g／L，酶活为 3600U／InL，且目的蛋白占发酵液中总分泌蛋白的 90％以上，发酵液中杂蛋白含量很少。因此本研究开辟了一条产量高、分离纯化简便、廉价大规模生产乳糖酶的新途径。 4．初步进行了亮白曲霉的乳糖酶水解新鲜牛奶的应用效果研究。将不同酶量的孪糖酶O000U、1500U）分另添力到10mL牛奶中，测定在不同温度下OZ℃、37OC、50oC、60oCX不同时间内，乳糖酶对牛奶中的乳糖的水解程度。通过高压液?