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外植体褐变是影响植物组织培养成功的一个重要因素，研究认为酚类物质的酶促氧化是组织褐变的直接原因。对蝴蝶兰叶片外植体褐变的研究多集中在生理水平上，从基因和蛋白水平研究褐变将有助于全面认识褐变发生的分子机理，对建立蝴蝶兰优良的遗传转化体系具有重要作用，对解决组织培养褐化问题具有重要的价值。 本研究以蝴蝶兰幼苗为研究材料，对叶片外植体组织培养早期(0～3d)褐变率进行了统计，分析了PPO酶活性变化，通过western blot检测了PPO蛋白表达，通过免疫组织化学染色方法和免疫胶体金电镜技术分别对PPO在蝴蝶兰叶片外植体中进行免疫组织定位和细胞定位;分析了蝴蝶兰叶片外植体组织培养褐变发生过程中PPO的表达与定位，以期为认识PPO在外植体褐变发生中的作用提供基础，获得的主要研究结果如下: 1.在蝴蝶兰叶片外植体培养的早期褐变率逐渐增加，培养3d时将近42％植体不同程度上发生褐变;叶片外植体中PPO酶活性逐渐增加，培养3d的外植体较培养0d时PPO酶活性显著增加;蝴蝶兰叶片外植体中PPO蛋白表达表现出与PPO酶活性相似的变化趋势，培养3d的外植体PPO蛋白含量有所增加;表明蝴蝶兰叶片外植体褐变发生与PPO之间存在相关性，外植体组织培养过程中PPO蛋白表达增加使PPO酶活性增加，从而促进了外植体褐变的发生。 2.将PPO氧化底物之一儿茶酚300mg/L加入培养基对蝴蝶兰叶片外植体进行共培养，与不加儿茶酚的对照相比，培养3d时外植体褐变率明显增加，PPO酶活性和蛋白表达与对照差异不明显，表明儿茶酚促进褐变发生过程与PPO表达关联不大，推测是酶促褐变底物儿茶酚增加，形成更多的褐变产物从而使褐变更加严重。用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)100mg/L加入培养基进行共培养的蝴蝶兰叶片外植体与不加CHX的对照相比，培养3d时外植体褐变率有所下降，PPO酶活性和蛋白表达明显低于对照，表明CHX可以抑制褐变发生，推测由于CHX抑制PPO蛋白合成降低了PPO酶活性，在一定程度上抑制了褐变的发生。 3.通过免疫组织化学染色方法对蝴蝶兰叶片外植体组织培养过程中PPO进行免疫组织定位结果显示，在维管组织着色较深，叶肉细胞和皮层等部位着色较浅，随着培养时间延长维管组织染色也逐渐变深，培养3d的外植体较培养0d时相比维管组织染色深度显著增加，表明在蝴蝶兰叶片外植体维管组织中PPO分布较多，在外植体组织培养过程中维管组织PPO蛋白表达增加。对蝴蝶兰叶片外植体组织培养过程中PPO免疫细胞定位结果显示，外植体组织培养0d时仅在细胞叶绿体上发现有胶体金标记，培养3d时较0d相比叶绿体上胶体金标记位点明显增多，在叶绿体周围细胞质和囊泡中也出现胶体金标记，表明蝴蝶兰PPO主要定位于叶绿体，外植体组织培养过程中PPO在细胞质中逐渐合成并转运到叶绿体和囊泡，使叶绿体PPO含量逐渐增加，存在于细胞质和囊泡中的PPO可能参与了酶促褐变的发生。 综上所述，PPO在蝴蝶兰叶片外植体组织培养酶促褐变中起到重要作用。蝴蝶兰叶片外植体酶促褐变是一个复杂的过程，外植体中酚类物质氧化成醌受到PPO的催化作用。酚类物质形成及其氧化代谢还受到PAL和POD的催化作用，它们共同调控了蝴蝶兰叶片外植体组织培养酶促褐变的发生。