论文部分内容阅读
目的p120-catenin(p120ctn)作为连环素家族的成员,在细胞黏附和信号转导中起着至关重要的作用。人类p120ctn基因有21个外显子,根据其剪切的不同,理论上可产生32个亚型,所有的亚型都具有相同的Armaadillo重复序列,只是C端或N端不同。根据其起始翻译密码的不同,人类的p120ctn可分为4种亚型,但各亚型的生物学功能至今尚未阐明。目前p120ctn在人肺癌中的研究很少,其在肺癌中表达的亚型种类及表达情况仍不清楚。本研究采用免疫荧光、Western Blot和RT-PCR方法,观察了p120ctn及其各亚型在肺鳞癌、腺癌和肺巨细胞癌PG细胞系中的表达及意义,并探讨其与肺癌的临床病理因素的关系。方法1、材料原发性肺鳞癌、腺癌标本来自中国医科大学附属第一医院行外科手术切除的标本。所有患者术前均未接受放化疗,术后常规化疗。标本均经4%中性甲醛固定,石蜡包埋,HE常规染色后明确诊断。其中部分标本取出后立即放入-70℃冰箱保存备用。2、细胞培养人肺巨细胞癌PG细胞系BE1和LH7亚系细胞由北京医科大学惠赠,BE1比LH7具有更高的转移能力。接种2×10~5细胞于35mm培养皿中,RPMI1640培养液(GiBCO公司)加10%胎牛血清(GiBCO公司),于37℃,含5%CO2的湿润空气培养箱中培养。细胞爬片24小时后,丙酮固定10min备用。3、免疫荧光固定后的冰冻组织切片和细胞爬片用0.2%Triton X-100处理15min。正常非免疫动物血清37℃孵育30min。滴加p120ctn鼠抗人单克隆抗体(1:400,BDTransduction Laboratories),4℃孵育过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,每次5min,重复三次。滴加罗丹明标记羊抗鼠荧光标记二抗(1:200,北京中杉),37℃孵育30分钟。PBS冲洗,每次5min,重复三次。DAPI(1:200,SIGMA公司)核复染30min;PBS冲洗;50%甘油封片,荧光显微镜于波长为527nm处观察罗丹明荧光强度,于372nm波长处观察DAPI的荧光染色,确定p120ctn的表达及定位。4、Western Blot将含50μg总蛋白的组织裂解产物进行SDS-PAGE电泳1.5h后,转印至PVDF膜(100V,2h),1%牛血清白蛋白室温封闭1h,经TTBS(20mmol/L Tris-HCL,500mmol/L NaCL,0.05%Tween-20)冲洗3次,抗p120ctn单克隆抗体(1:400,BD Transduction Laboratories)4℃孵育过夜后,辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育1h,TTBS洗三次后DAB显色。以β-actin为内对照,用凝胶成像分析系统(Biolmaging Systems,美国)测定p120ctn各条带灰度值,并取其与β-actin的比值为相对表达量分析p120ctn各亚型的表达情况。5、RT-PCR采用TRIZOL试剂(invitrogen,美国)提取组织细胞总RNA后,利用RNA PCRKit(AMV)Ver.3.0试剂盒(TaKaRa)进行RT-PCR,按说明书操作。PCR反应条件为:94.0℃40s,53.0℃40s,72.0℃1.0min,30个循环,72.0℃5min延伸。β-actin:PCR反应条件为:94.0℃40s,55.0℃40s,72.0℃40s,30个循环,72.0℃5min延伸。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,以100bp DNA Marker为分子量标准。用自动电泳凝胶成像分析系统(Biolmaging Systems,美国),测定扩增带灰度值,以β-actin为内参照,得到p120ctn的相对表达量。6、统计分析各组资料利用SPSS for Window 11.5进行统计分析。p<0.05有统计学意义。结果正常肺组织中p120ctn蛋白以亚型1(120KD)和亚型3(100KD)的表达为主,而在肺癌组织和PG细胞系中则出现1、3亚型(特别是1亚型)表达缺失或减弱。正常肺组织中p120ctn mRNA可见1.2、1.3、2.3、3.1及3.3五条亚型带,而在肺癌组织和PG细胞系中各亚型出现不同缺失或减弱。并且这种亚型减弱或缺失的现象与肺癌淋巴结转移有不同程度的相关性:p120ctn亚型1与肺癌的淋巴结转移呈负相关,而亚型3与肺癌淋巴结转移呈正相关。结论在正常肺组织中p120ctn的表达以亚型1和亚型3为主,而在肺癌组织中这两种亚型表达减弱或缺失,并且它们的异常表达在肺癌进展过程中可能起到了不同的作用。