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喜树碱(camptothecin，CAM)，属于萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids，TIAs)，最早于1966年由Wall等人从我国特有植物喜树(Camptotheca acuminata)的木质部中分离获得，其抗癌机制独特，对恶性肿瘤和实体肿瘤均有良好的疗效，是迄今为止发现的唯一通过抑制拓扑异构酶Ⅰ发挥抗肿瘤作用的天然植物活性成分。喜树碱类药物是全球第三大植物药物，其临床的大量使用使得喜树碱的需求量较大。目前，虽然已有采用化学合成进行喜树碱全合成的报道，但是从植物中提取分离还是喜树碱的主要来源。然而，喜树碱类化合物在植物中的含量较低，并且产喜树碱的植物生长缓慢，因而研究喜树碱的生物合成途径及其合成机制将为利用生物技术提高喜树碱的产量奠定理论和技术基础。 喜树碱在植物内的生物合成途径研究已取得了一定成果:异胡豆苷(strictosidine)之前的代谢途径已有一小部分研究，其中己报道的有，邻氨基苯甲酸合成酶(anthranilate synthase，AS)、色氨酸合成酶(tryptophan synthase，TS)、色氨酸脱羧酶(tryptophan decarboxylase，TDC)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)、香叶醇-10-羟化酶(geraniol10-hydroxylase，G10H)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate reductoisomerase，DXR)、异戊烯基焦磷酸异构酶(IPP isomerase，IPI)等。 本论文的主要研究内容是对喜树细胞色素P450还原酶(Camptothecaacuminata Cytochrome P450 Reductase，CaCPR)和喜树裂环马钱子苷合成酶(Camptotheca acuminata Secologanin Synthase，CaSLS)进行分子克隆和功能表征，获得的主要结果如下: 1.通过大量的生物信息比对、分析，我们根据已表征的植物CPR的保守氨基酸残基，设计了相应的简并引物，并以喜树幼苗总RNA为模板，通过RT-PCR技术获得了CaCPR的核心片段;在此基础上，通过5-和3-RACE技术获得了CaCPR的5-和3-序列，由此获得该基因的全长eDNA序列:全长为2606bp，包含一个编码708个氨基酸残基的开放阅读框，5-非编码区长度为135bp，3-非编码区长度为344bp，对CaCPR的跨膜区、亚细胞定位、信号肽进行了预测，还通过同源建模对其三级结构进行了预测。 2.将上述获得的CaCPR在大肠杆菌中进行了异源表达，并对重组蛋白进行纯化，随后对其还原细胞色素c的功能进行验证，同时就His-Tag对CaCPR还原细胞色素c活性影响进行了研究，研究发现，当His-Tag加在CaCPR的N-端时要比His-Tag加在CaCPR的C-端活性要强100倍以上。 3.本文除了对CaCPR还原细胞色素c的功能研究外，还测试了其对MTT和铁氰化钾的还原活性，同时还扫描了CaCPR蛋白的紫外-可见吸收光谱，发现其具有和其他CPR一样的紫外-可见吸收谱。 4.本研究发现CaCPR显示微弱的支持棉花肉桂酸-4-羟化酶(GhC4H)的活性，而膜定位部分氨基酸被截断的CaCPR(tCaCPR)却能成功将电子传递给GhC4H，支持GhC4H氧化酶对肉桂酸的4-位进行羟基化反应。用TargetP分析可以发现CaCPR可能定位于叶绿体膜，而GhC4H可能定位于内质网膜，这样就会使共表达这两个蛋白时，二者的亚细胞定位不一致，从而导致活性较弱。虽然同在大肠杆菌中，但是并不能有效的接触，从而导致CaCPR并不能将从NADPH获得的电子有效地传递给GhC4H，影响GhC4H活性。当tCaCPR和GhC4H共表达时，由于tCaCPR是去掉了膜锚定部分的CaCPR，表达出来是细胞质蛋白，而且表达量会相应增加，表达出来的tCaCPR会包裹在细胞器的周围，而GhC4H是一个外膜蛋白，这样tCaCPR就能够与GhC4H有效接触，从而将电子从NADPH成功传递给GhC4H。这一实验结果也为异源表达细胞色素P450还原酶时提供一种思路，当表达的目的蛋白没有预期活性时，可以考虑将其膜锚定区去掉。 5.本研究利用融合PCR，限制性内切酶酶切，核酸连接酶连接等技术、方法成功构建了专用于表征细胞色素P450及其还原酶的即插即用表达载体:用此载体只要对细胞色素P450氧化酶或者细胞色素P450还原酶进行替换即可。 6.本文采用融合表达策略，对NCBI中注释为喜树SLS的基因进行了分子克隆与异源表达。研究发现，在现有实验条件下CaSLS和阳性对照CrSLS的催化活性都较弱。生物信息分析显示，SLS为膜蛋白，而膜蛋白纯化相对较困难，而且纯化过程中，酶的活性容易丧失，故本研究只用了细胞破碎液的上清;另外，该酶催化反应的产物为裂环马钱子苷，其稳定性较差，所以我们检测到的上述两蛋白的活性均较弱，有待进一步的优化。