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随着人类对肿瘤等重大疾病的不断深入了解,人类也在接受着一个个重要的临床挑战。在长期临床护理当中人们发现,肿瘤患者常存在一个潜在病症那就是静脉血栓栓塞(VTE)并发症。在一项很具有前瞻性的记录中记载着:对5451例用超声确诊患有深度静脉血栓(DVT)的诊断中,有32%是肿瘤患者。肿瘤患者形成血栓的机理复杂,且目前治疗肿瘤及血栓的药物都为单一功能的药物。因此,构建出一种既抗肿瘤又溶栓的双效融合蛋白,对治疗肿瘤并发VTE病例具有重要意义。本研究利用小分子靶向肽奥曲肽(Octreotide,Oct)能与多数肿瘤细胞膜上表达的生长抑素受体以配体-受体方式特异性结合的特性,携带本实验室研制的抗肿瘤溶栓双效融合蛋白制成了具有靶向功能的双效融合蛋白,这将对于治疗癌症并发血栓的病例具有重要意义。实验室已将天然SEC2的N端和C端进行改造,分别剔除了 N端17个氨基酸和C端的132个氨基酸,分析得出该突变体ASEC2的超抗原活性得己保留,且降低了天然SEC2的免疫原性;类似的,实验室还构建出缺失了N端10个氨基酸但溶栓活性不变的葡激酶突变体蛋白,并将它与突变体Δsev2基因进行嵌合,分别得到了嵌合蛋白ΔSAK-ASEC2和ΔSEC2-ΔSAK。在已有的研究成果基础上,运用基因工程技术构建具有靶向肿瘤功能的融合蛋白。用镍离子层析柱纯化该融合蛋白;纤维蛋白平板法分析其溶栓活性;MTT法研究其抗肿瘤活性;蛋白印迹和免疫共沉淀法验证融合蛋白的特异性、专一性和靶向肿瘤细胞的功能。研究结果如下:1)质粒载体构建:利用基因工程手段,向pET-28a-Δsec2-Δsak和pET-28a-Δsak-Δsec2质粒载体中插入奥曲肽基因,通过PCR、酶切和测序等方法最终确认得到可以用于表达的重组质粒载体pET-28a-oct-Δsec2-Δsak和pET和-28a-oct-Δsak-Δsec2。2)融合蛋白的表达和纯化:将转化成功的克隆菌接种到培养基中培养,当克隆菌达到生长对数期附近时,用IPTG对E.coli进行诱导表达;利用冻融、溶菌酶等细胞破碎方法,破碎E.coli,离心并收集上清液,流过镍离子层析柱,经咪唑洗脱、透析除盐和冷冻干燥浓缩得到带His标签的融合蛋白His-OCT-ΔSEC2-ΔSAK和His-OCT-ASAK-ΔSEC2。使用凝血酶切割融合蛋白的N端His标签,再一次过镍离子层析柱,最终获得了电泳条带单一的、纯化效果较好的 OCT-ΔSAK-ASEC2 和 OCT-ASEC2-ΔSAK蛋白。3)融合蛋白的活性分析:得到纯化蛋白后进行活性的分析与检测。根据研究的目的主要分析融合蛋白以下几个生物学活性:蛋白体外抑制肿瘤细胞生长活性、促进PBMC细胞增殖活性、溶解血栓能力、融合蛋白作为抗原的特异性和专一性以及针对肿瘤细胞的靶向功能验证。以上活性的检测所用的方法分别有MTT法、纤维蛋白平板法、免疫印迹和免疫共沉淀技术。实验所得到的结果有:OCT-ΔSAK-ΔSEC2和OCT-ΔSEC2-ΔSAK具有ΔSEC2的超抗原活性,能刺激PBMC细胞的增殖、有抑制人胃癌BGC-823细胞生长的能力;有与葡激酶相似的体外溶栓活力;能与肿瘤细胞人胃癌BGC-823结合。由此可以得到的结论,OCT-ΔSAK-ΔSEC2和OCT-ΔSEC2-ΔSAK被成功构建和表达,且具有超抗原活性,能有效刺激T细胞增殖;通过T细胞增殖等变化能有效遏制肿瘤细胞的生长;由于还包含截短突变体ΔSAK,所以还有强烈的溶栓作用;通过Oct的介导,融合蛋白能有效的与肿瘤细胞表达的膜受体SSTR2相结合。该研究将对于靶向治疗肿瘤并发血栓的病例具有重要意义,将可能成为新型治疗药物并为其进一步的研究和开发奠定良好的基础。