华南地区香蕉三种病毒病的检测体系的建立

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香焦是单子叶草本植物,属芭蕉科(Musaeeae)芭蕉属(Musa),是重要的粮食和经济作物,在我国南方各省均有大面积种植。香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)及香蕉线条病毒(Bananastreak virus,BSV)引起的香蕉病毒病是香蕉产业发展中的主要限制因子之一。快速稳定的病毒检测技术是保障香蕉无毒种苗的生产和控制病害的一个根本途径。   香蕉束顶病威胁着包括亚洲、非洲和南太平洋地区约世界四分之一的香蕉生产。本研究主要根据己报道的BBTV分离物CP基因序列设计引物,以采自广州的具有束顶病症状均香蕉组织总DNA为模板,通过PCR方法扩增出大小为513 bp的BBTV的CP基因,并将CP基因重组到细菌表达载体pET-28b(+)中,酶切和测序均表明成功构建了表达载体pET-28-CP。将重组表达载体分别导入表达宿主菌Escherichia coliRosetta(DE3)中并且得到高效表达,获得了目的蛋白并制备了特异性抗血清,这为进一步研究BBTV病毒基因的表达和功能奠定了基础。   根据GenBank中已发表的香蕉束顶病毒(BBTV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和香蕉线条病毒(BSV)的基因序列,找出保守序列并分别设计特异引物。在建立各种病毒单重PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,从而建立了能同时检测香蕉三种病毒的多重PCR检测体系。该体系可同时扩增BBTV615 bp、CMV480 bp和BSV945 bp大小的特异片段。这些片段经克隆测序结果表明,多重PCR扩增的不同病毒片段都是特异和专化的,其核苷酸序列与相应的病毒基因片段的相似性都达95%以上。该体系的灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg感病植物组织中均能检测到这三种病毒。   通过将黄瓜花叶病毒(CMV)接种到心叶烟上的方法获取大量感病的植物材料,采用差速高速离心方法提取CMV病毒粒子,经检测病毒含量达到2 mg/mL。免疫新西兰兔,制各CMV抗血清,利用抗体纯化试剂盒提纯抗体,制备得到了4 mg/mL的CMV抗体。采用柠檬酸三钠还原氯金酸,制备胶体会颗粒。根据不同粒径的胶体金颗粒在检测时所呈现的颜色鲜艳程度,选择直径20 nm-30 nm的胶体金颗粒作为标记物,制备成胶体金免疫层析试纸条。经试验发现胶体金标记最低抗体标记量为20μgmL,最适PH为7.5,羊抗兔抗体的点样浓度为2 mg/mL,CMV抗体的点样浓度为2 mg/mL,制作的免疫试纸条能够在10分钟内显色。将试纸条保存在4℃下可以保存至少三个月仍旧有效。
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