【摘 要】
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产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是导致新生仔猪腹泻最常见的病原性大肠杆菌,能引起新生仔猪和断奶仔猪腹泻,发病率高,死亡率也高。耶尔森菌强毒力
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产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是导致新生仔猪腹泻最常见的病原性大肠杆菌,能引起新生仔猪和断奶仔猪腹泻,发病率高,死亡率也高。耶尔森菌强毒力岛(High-pathogeniticity island,HPI)最早是在高致病性耶尔森菌中发现,与铁载体的合成、摄取、运输有关,并且与耶尔森菌的毒力和致病性相关,对小鼠有强致死性。已有研究发现禽致病大肠杆菌(AvianpathogenicE.coli,APEC)中也存在HPI,并且与细菌的毒力密切相关。本实验室前期在对K88 ac + ETEC国内参考株C83902的全基因组测序中识别到一个约29kb的毒力岛,与耶尔森菌HPI高度同源。为了探究HPI在K88ac+ETEC的功能作用,本研究针对K88ac+ETEC C83902中强毒力岛HPI设计了如下试验。1、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建强毒力岛HPI缺失株根据本实验室前期对C83902进行全基因组测序的结果,设计针对强毒力岛HPI缺失的引物,分别将能合成sgRNA的基因和HPI上下游同源臂融合到质粒pTarget上,构建重组质粒pTargetT,该质粒能稳定表达sgRNA并提供同源重组的修复模板。将重组质粒和含有编码Cas9基因以及λ-RED重组酶系统基因的pCas质粒电转化入野生株C83902,进行强毒力岛HPI的无痕敲除;通过PCR验证,成功获得了基因缺失株C83902△HPI。2、强毒力岛HPI在K88ac+ETEC C83902中功能探析在C83902△HPI构建成功的基础上,比较分析了野生株和缺失株的相关生物学特征的变化。体外生长试验表明,在相同的培养条件下,野生株C83902和缺失株C83902△HPI在生长周期的各个阶段的生长速度基本一致。在养分充足的条件下,缺失株的铁载体合成量与野生株基本一致,没有明显变化。生物被膜定量试验表明缺失株的生物被膜形成能力明显低于野生株,下调了 50.97%(P<0.05)。细菌与仔猪空肠上皮细胞IPEC-J2的粘附试验结果显示,缺失株对IPEC-J2细胞的粘附能力较野生株下降23.3%。研究进一步通过Real-TimePCR试验检测强毒力岛HPI缺失株中重要毒力因子K88菌毛、sfm菌毛、丝氨酸蛋白酶、Ⅰ型菌毛、共生菌毛、荚膜、α菌毛、鼠伤寒沙门菌菌毛、长极性菌毛、鞭毛、溶血素和弯曲菌毛等的主要亚单位编码基因的转录量变化,结果发现,与野生株相比,faeG的表达量下降了 12.02%,sfmH的表达量下降了 15.58%,sep 的表达量下降了 37%(P<0.01),fimH的表达量下降了 11.78%,ecpA表达量下降了 30.4%(P<0.05),kpsD的表达量下降了 37.5%(P<0.05),clbD的表达量下降了 37.75%(P<0.05),stfG的表达量下降了 34.84%(P<0.01),ipfA的表达量下降了 35.3%(P<0.01),fliC 的表达量下降了 41.2%(P<0.01),而hlyA和csgB的表达量几乎没有变化。综上所述,K88ac+ETEC C83902中HPI影响细菌生物被膜的形成,并且参与sepA、ecpA、kpsD、cblB、stfG、ipfA、fliC等基因及相关蛋白的表达调控,从而影响细菌毒力,但其并不是细菌唯一的铁载体合成基因。
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