论文部分内容阅读
流感是一种全球性的传染性疾病。季节性流感中成人的发病率约为5％，儿童的发病率约20%。全球每年流感重症患者达300～500万人，死亡达25～50万人。尽管已有的抗流感药物具有良好的治疗作用，但是耐药性的产生以及新病毒亚型的出现时刻对其疗效发出挑战。因此，新型防治流感药物的发现一直是医药科学研究者们努力的方向。
本论文在深入认识流感病毒结构、功能以及致病特点的基础上，在病毒和宿主相互作用的多个环节中寻找潜在的药物作用靶点，建立相应的筛选模型，以期发现具有抗流感作用的先导化合物。本论文研究内容主要包括以下几方面：
一、RNA聚合酶高通量筛选模型的建立
流感病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)是由PA、PB1和PB2构成的异源三聚体。除了RNA依赖的RNA聚合酶的活性，RdRp还具有核酸内切酶、蛋白酶以及核酸外切酶等活性。RdRp是病毒基因组复制转录过程中的关键酶，其抑制剂的发现对于病毒复制机制研究以及抗病毒新药的发现都具有重要意义。目前已有RdRp抑制剂进入临床Ⅲ期研究。
本章从流感病毒中直接提取RdRp，建立了其活性测定方法。RdRp已有的活性测定方法依赖于放射性同位素标记的核苷酸，不仅成本高、需要特定的防护措施，而且操作繁琐、无法准确定量。我们利用RNA聚合反应中消耗ATP的特点，通过测定体系中剩余的ATP含量反应RdRp活性。本方法使用的商品化ATP检测试剂直接加入微孔板便可用酶标仪测定反应程度，具有操作简单、安全、准确、灵敏的特点，适用于大量样品的活性评价。应用该方法，我们建立了RNA聚合酶抑制剂高通量筛选模型，并对样品库中部分样品进行了筛选，但并未发现活性化合物。
二、流感病毒内切酶抑制剂筛选模型的建立
内切酶是构成RdRp的PA蛋白的N端片段，在宿主细胞内切割含有Cap-1结构的pre-mRNA作为引物启动病毒基因转录。内切酶催化的这一反应不仅是病毒复制的必需步骤，而且是病毒抑制宿主基因表达的机制之一。由于哺乳动物体内并不存在类似的生化反应，流感病毒内切酶特异性抑制剂很可能成为高效低毒的抗流感药物。内切酶的活性中心在2009年刚刚确定，还没有抑制剂进入临床前研究。建立内切酶抑制剂筛选模型不仅有利于对内切酶功能特点进行深入研究，同时对发现具有全新作用机制的防治流感的药物具有重要意义。
本章建立了流感病毒内切酶的原核表达体系，获得了具有活性的纯化内切酶蛋白。同RNA聚合酶一样，已有的内切酶检测方法依赖于放射性同位素标记的底物，需要对反应产物进行电泳以进行定性定量分析。我们以M13噬菌体基因组环状ssDNA为底物，设计了基于外切酶-染料的内切酶活性测定方法。该方法首先进行内切酶反应，使底物环状ssDNA降解成线性ssDNA片段；随后线性ssDNA在核酸外切酶作用下降解生成dNDP，链长度缩短。利用ssDNA特异性荧光染料对体系剩余ssDNA进行定量，即可反应内切酶活性。本方法避免了放射性同位素的使用，操作简便，灵敏准确，能够实现自动化操作进行高通量筛选。另外，本章还利用内切酶的晶体结构，利用分子对接对样品库中化合物进行虚拟筛选，并对具有潜在内切酶抑制活性的化合物进行了活性评价。
三、神经氨酸酶抑制剂筛选模型的再评价
神经氨酸酶(NA)抑制剂是临床常用抗流感的药物，本实验室己于2002年建立了NA抑制剂高通量筛选模型并对大量化合物进行了活性评价。长期应用过程中发现，该模型易受多种因素干扰，不同批次的检测结果往往难以整合。因此，本章对已有模型进行进一步优化，以测定酶活性为基础，以评价抑制剂作用为研究目标，建立活性测定的标准方法。同时，对该方法的准确性和稳定性予以评价，确定测定结果的可靠、准确、稳定。
不确定度利用测量值分散性表示测定的准确程度，比误差理论更具有科学性。对于高通量筛选模型，不确定度评价可以从验证方法有效性、数据等效性和明确差异显著性等方面对模型的准确性和稳定性予以说明。采用不确定度作为筛选模型质量的衡量指标，是提高活性化合物发现效率的途径之一。
四、3-脱氧苏木查尔酮抗流感作用及其机制研究
3－脱氧苏木查尔酮是利用流感病毒NA抑制活性示踪苏木化学成分分离获得的活性化合物。本章在细胞水平上确认了其体外抗流感活性，明确其作用特点，并且对其作用机制进行初步探讨。实验结果表明3-DSC不影响病毒引起的红细胞凝集，仅在较高浓度(30μM)时对宿主细胞内病毒基因复制以及蛋白表达具有抑制作用。
随后，我们又从宿主因素入手考察了3-DSC其对病毒诱导的细胞凋亡和细胞因子分泌的影响。结果表明3-DSC在1.2μM、6μM和30μM浓度下能够剂量依赖性减少病毒感染后宿主细胞的凋亡，并抑制caspase3/7、caspase8和caspse9的激活；剂量依赖性减少感染后内皮细胞分泌趋化因子CCL5和CXCL10，减少巨噬细胞分泌细胞因子IL-6和IL-1β。综合以上实验结果，我们推测3-DSC体外抗流感机制包括抑制病毒复制、抗凋亡和抗炎三方面。
综上所述，本研究根据对流感病毒复制过程以及致病因素理性认识，以药物作用靶点为中心，以抗流感活性评价新模型的建立、已有模型的优化以及活性化合物的深入评价为主要内容，探讨了新型防治流感药物发现的方法、特点和规律，为新药研究提供了实验基础。