产抗TMV活性物质鸦胆子内生真菌的分离、鉴定及发酵条件优化

• 作 者: 王福荣
• 出 处: 福建农林大学
• 发表日期: 2014年01期
• 关键词: 鸦胆子 内生真菌 抗TMV病毒活性 分类鉴定 发酵优化

本论文以传统中药植物鸦胆子为材料,对其不同器官中的内生真菌进行分离,对分离到的内生真菌通过液体摇瓶发酵培养,获得相应的代谢产物,以烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)为靶标,对各菌株次生代谢产物的抗TMV活性进行测定,筛选出对TMV侵染和增殖均有抑制作用的菌株,并对该菌株进行鉴定,优化菌株产活性物质的发酵条件,分离、纯化菌株代谢产物中抗TMV活性物质,主要结果如下:从鸦胆子的根、茎、叶和花中共分离到内生真菌138株,其中根中分离到38株,从茎中分离到45株,叶子中45株,花中10株。将138株真菌在25℃、120 r/min的条件下液体摇瓶发酵后,采用圆叶片法对内生真菌发酵液粗提物抑制TMV增殖活性进行筛选。结果表明,其中39株内生真菌的发酵液提取物在1 mg/mL浓度下抑制TMV增殖活性,达50%以上,菌株R11的抑制效果最好,抑制率可达75.4%。对TMV增殖抑制率达50%以上的39株菌株发酵提取物,采用半叶枯斑法测定其抑制TMV侵染活性,每株菌重复5次,结果表明,有25株内生真菌的发酵液提取物在1 mg/mL浓度时,对TMV侵染抑制率达80%以上。活性最好的能达到 100%。采用形态学鉴定和ITS序列测定,将对TMV侵染和增殖抑制效果最好的菌株R11鉴定为曲霉属、黑曲霉菌。通过发酵培养基的筛选实验,选用沙氏培养基作为发酵基础培养基进行优化。经单因素优化试验和正交试验,确定了 R11产抗TMV活性物质的最佳发酵条件为,碳源蔗糖30 g/L,氮源酵母粉15 g/L,CaC12 1.5 g/L、发酵时间15 d,温度28℃,125 r/min,初始pH值6,接种量15%,装瓶量250 mL的三角瓶120 mL。发酵优化后的发酵液粗提物在1 mg/mL时,抗侵染抑制率为97.26%,较优化前提高了 2.1%,抗增殖抑制率为82.91%,较优化前提高了 7.56%。通过发酵优化实验,我们提高了菌株R11抑制TMV病毒活性物质的能力,为该菌株的进一步开发奠定了研究基础。利用柱层析法从R11菌株发酵液中分离活性单体,经活性测定显示:该单体抑制TMV侵染和增殖的IC50分别为23.7 μg/mL和46.5 μg/mL。