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研究背景:结直肠癌(colorectal cancer)是全球第三大常见的恶性肿瘤,占恶性肿瘤致死的第四位[1]。近年来随着生活习惯的改变和人口结构的老龄化,结肠癌逐渐成为危害我国居民健康的重大疾病,2015年我国结直肠癌新发病例和死亡病例分别为376300例和19100例,且发病率呈上升趋势[2]。结肠癌目前的治疗手段包括手术、放疗、化疗、靶向治疗等,尽管这些治疗方法取得了巨大进步,但绝大部分病人最终死于肿瘤的复发和转移。因此,探索一种针对结肠癌更加有效的治疗手段迫在眉睫。基因治疗能有效作用于肿瘤发生、发展的关键节点,是目前肿瘤研究的热点领域。溶瘤腺病毒能在肿瘤细胞中特异性的复制并裂解肿瘤细胞,进而释放的病毒感染邻近肿瘤细胞,发挥级联放大作用。此外,溶瘤腺病毒裂解肿瘤细胞释放的肿瘤抗原,可激活局部和全身抗肿瘤免疫,从而达到治疗肿瘤的目的;同时,溶瘤腺病毒能够介导治疗基因在肿瘤局部的高效表达。Decorin是富含亮氨酸小分子蛋白聚糖(prototypic member of the small leucine-rich proteoglycans,SLRPs)家族成员之一。研究发现,decorin在细胞粘附、迁移、增殖、凋亡、自噬、分化、炎症和肿瘤发生及发展过程中均发挥重要作用。目前已有多项研究证实,decorin在多种肿瘤组织中表达下调。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF),具有促进巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cells,DCs)成熟与分化等作用,已在多项临床研究中证实具有显著的抗肿瘤作用。因此,我们以溶瘤腺病毒为载体,以decorin和GM-CSF为治疗基因构建溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM,评价其体内外抗肿瘤作用和免疫激活作用并探索其机制。目的:将溶瘤腺病毒与治疗基因相结合,构建携带治疗基因decorin和GM-CSF的溶瘤腺病毒,评价其体内外抗肿瘤作用和免疫激活作用并探索其机制。材料和方法:首先,收集我院2010年1月至2013年12月共59例结直肠手术病人的肿瘤组织、癌旁组织和正常肠组织,根据病理分析结果进行冻存;收集病人住院资料及随访资料;采用real-time RT-PCR和免疫组化检测肿瘤组织和相应的正常组织中decorin的表达水平,同时,采用real-time RT-PCR检测decorin靶基因Met和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的表达水平。其次,采用Adeasy系统构建携带decorin基因的复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd.DCN,并在HEK293细胞中包装获得重组腺病毒Ad.DCN。然后,我们在HEK293细胞中大量扩增复制缺陷型重组腺病毒Ad.Null、Ad.DCN,和溶瘤腺病毒rAd.Null、rAd.DCN、rAd.GM和rAd.DCN.GM,然后采用CsCl密度梯度离心纯化病毒,采用紫外分光光度法测定病毒的颗粒滴度和纯度。再次,在结肠癌细胞中,对溶瘤腺病毒的体外功能进行评价。分别采用溶瘤腺病毒和复制缺陷型重组腺病毒感染结肠癌细胞SW480、SW620和CT26.WT,然后,采用病毒噬斑扩增法测定病毒在结肠癌细胞中的复制能力;采用ELISA法检测细胞培养上清中decorin和GM-CSF的表达水平;采用磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)染色法检测溶瘤病毒对结肠癌细胞的杀伤效应。同时,分离结直肠癌病人的外周血单个核细胞,采用溶瘤腺病毒感染的结肠癌细胞制备条件培养液,用条件培养液刺激单个核细胞后,检测单个核细胞的增殖能力和细胞因子的表达水平。最后,采用小鼠CT26.WT细胞在Balb/c小鼠建立具有完全免疫系统的皮下结肠癌模型,然后,采用瘤内注射溶瘤腺病毒的方式进行治疗,观察小鼠的健康状态、肿瘤的生长曲线,通过病理检测肿瘤及各脏器,采用流式细胞术检测免疫细胞的表型,通过real-time PCR检测目的基因、decorin靶基因、细胞因子和化学趋化因子表达等,进而评价溶瘤腺病毒对结肠癌的治疗作用和机制。结果:在结直肠癌病人肿瘤组织中,decorin蛋白和mRNA的表达显著下调。其中31例结肠癌病人的肿瘤组织中,有28例的decorin表达下调;28例直肠癌病人中,26例表达下调。并且,decorin的表达水平与直肠癌的复发与转移密切相关。同时,我们发现,decorin表达下调可以上调其主要靶基因Met和VEGFA的表达水平,可能与肿瘤的发展与转移密切相关。接下来,我们成功构建携带decorin(DCN)和GM-CSF(GM)的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM及其对照病毒rAd.Null、rAd.DCN、rAd.GM;同时,还成功制备了复制缺陷型重组腺病毒Ad.Null和Ad.DCN。成功扩增和纯化得到高质量的病毒产品,用于体外和体内功能的评价。然后,体外实验证实溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM能够发挥体外溶瘤功能并介导目的基因的高效表达。(1)ELISA结果显示,rAd.DCN.GM、rAd.DCN和Ad.DCN能够有效表达decorin蛋白,而rAd.DCN.GM和rAd.GM可有效表达目的蛋白GM-CSF;(2)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM在人结肠癌细胞系SW480和SW620中复制能力明显高于复制缺陷型腺病毒;而在小鼠结肠癌细胞CT26.WT细胞中,没有检测到溶瘤腺病毒明显的复制能力;(3)SRB检测结果显示,溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM对人结肠癌细胞系SW480、SW620和鼠结肠癌细胞系CT26.WT均能产生显著的细胞毒性作用;(4)复制缺陷型腺病毒Ad.DCN感染SW480的结果显示,decorin能显著下调重要靶基因c-Met、VEGFA、CNTTB1、TGF-β的mRNA表达。同时,有效抑制结肠癌细胞的迁移;(5)溶瘤腺病毒感染SW480的细胞裂解液,能够激活人外周血单个核细胞中多种细胞因子的表达。最后,我们成功建立了具有正常免疫系统的Balb/c小鼠结肠癌移植瘤模型(CT26.WT皮下移植瘤),在体内对溶瘤腺病毒的抗肿瘤及免疫激活作用进行评价。主要结果包括:(1)溶瘤腺病毒能够有效抑制结肠癌移植瘤的生长,而携带目的基因的溶瘤腺病毒具有更强的肿瘤抑制作用;(2)病理检测结果显示,溶瘤腺病毒没有显著的肝脏和脾脏毒性;溶瘤腺病毒能够促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖,并抑制肿瘤的肺转移,其中,rAd.DCN.GM对肺转移具有最强的抑制效应;(3)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM介导目的基因decorin和GM-CSF在肿瘤局部的高效表达,可上调E-cadherin、下调VEGFA、N-cadherin和Vimentin的表达;增强化学趋化因子perforin和granzyme B的表达;(4)溶瘤腺病毒可提升外周血中CD8+T淋巴细胞的比例;促进脾脏中DCs的分化和成熟;抑制脾脏内Th2型细胞因子IL-6、TNF-α和TGF-β的表达;促进脾脏INF-γ的表达。结论:结直肠癌病人肿瘤组织中decorin表达显著下调,且与肿瘤的复发和转移密切相关;本研究成功制备了携带decorin和GM-CSF基因的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM,rAd.DCN.GM能够在结肠癌细胞中有效复制并杀伤肿瘤细胞,同时,高效介导目的基因decorin和GM-CSF的表达;rAd.DCN.GM能够有效抑制结肠癌CT26.WT移植瘤的生长,激活抗肿瘤免疫反应。因此,rAd.DCN.GM有望发展成为治疗结肠癌的基因治疗候选药物。