SELEX技术筛选金黄色葡萄球菌毒性休克综合征毒素-1适配体及其功能研究

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目的:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的毒性休克综合征毒素-1(Toxic Shock Syndrome Toxin-1,TSST-1)引发中毒性休克综合征(Toxic ShockSyndrome,TSS),通过激活T淋巴细胞使其活化、增殖,引起强烈的免疫应答。目前针对TSST-1本身的治疗手段不多,合成寡核苷酸文库和亲和力筛选作为获得高亲和力、高特异性适配体(Aptamer)的一种方便、快捷、有效的方法。本研究利用指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment,SELEX)筛选具有高亲和力并特异性识别TSST-1的DNA适配体,并评估适配体对TSST-1功能的抑制作用,为探索金黄色葡萄球菌TSST-1诱导TSS新的治疗方法奠定实验基础。  方法:我们选取TSST-1作为靶标,体外合成中间含有25个随机序列全长为63个碱基的单链DNA(ssDNA)文库。利用指数富集的配体系统进化技术,以羧基磁珠作为固相介质,从ssDNA文库中筛选TSST-1适配体,利用生物信息学方法对适配体进行序列同源性分析和二级结构预测,通过凝胶阻滞实验验证适配体结合性质,运用荧光定量法分析候选适配体的亲和力及特异性,CCK-8法检测候选适配体对TSST-1刺激PBMCs增殖抑制反应。  结果:经过8轮的反复筛选,监测ssDNA文库的亲和力不断升高,获得了特异性识别TSST-1的DNA适配体T-7,其全长为63nt。它可选择性的与TSST-1结合,而与BSA,裸磁珠的交叉结合力较弱,并测定其与TSST-1的解离常数为103.8nM。当适配体为10μM时,可有效抑制TSST-1介导的PBMCs增殖作用(P<0.05),其抑制率达63.6%。  结论:本研究利用bead-SELEX技术筛选出新型适配体T-7,它能选择性识别TSST-1。在体外实验中,该适配体能使TSST-1刺激PBMCs的增殖水平明显降低(P<0.05)。因此,在金黄色葡萄球菌TSST-1诱导TSS的治疗和诊断方面具有潜在应用前景。
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