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聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是许多细菌和极端嗜盐古菌在营养不平衡条件下（如碳源充足，氮源不足）合成的胞内聚酯，是碳源和能源的储备物，可用作生物可降解塑料以替代传统的石油化工塑料。相比于细菌PHA产生菌株，极端嗜盐古菌具有一些明显的优势，可以作为候选PHA生产菌株。极端嗜盐古菌Haloarcula hispanica是一株天然的PHA产生菌，对其PHA生物合成及其可能的调控机制进行深入研究，将为极端嗜盐古菌PHA生产菌的遗传工程改造提供理论基础。我们综合运用了遗传学、基因组学、转录组学和蛋白组学等方法。 首先，我们成功构建了H.hispanica中高效的、低假阳性率的基因敲除系统，即pop-in/pop-out系统。该系统包含两部分:尿嘧啶营养缺陷型宿主ΔpyrF和携带pyrF选择标记基因的自杀质粒。乳清酸核苷5-磷酸脱羧酶PyrF(编码基因pyrF)是尿嘧啶合成途径最后一步的关键酶，能代谢底物类似物5-FOA，产生细胞毒性的5-FU。敲除pyrF基因，得到相应的尿嘧啶营养缺陷型ΔpyrF突变体，该突变体失去了从头合成尿嘧啶的能力，不能再代谢5-FOA产生5-FU。因而，该敲除系统的构建就基于pyrF基因，将其作为营养缺陷型选择标记基因连入自杀质粒，转化ΔpyrF营养缺陷型宿主。在尿嘧啶缺陷培养基上，筛选尿嘧啶原养型质粒整合单交换重组子（正向选择）。随后在5-FOA反向选择压力下，利用分子内同源重组，发生第二次交换质粒丢失，产生目的基因敲除突变株或回复突变菌株。 随着测序技术的发展，基因组学相关研究已成为热点。为了在基因组或系统水平对H.hispanica进行基因功能、代谢网络及调控和应用方面的深入研究，我们完成了H.hispanica全基因组序列的拼接和注释。其基因组大小约3.9 Mb，共编码3859个蛋白基因。含有三个环形复制子，平均GC含量62.5％。通过查找基因组注释信息，我们发现该菌中存在PHBV合成相关基因及关键前体供应途径。 运用MALDI-TOF/TOF PMF和MS/MS相结合的方法，建立了H.hispanica较广泛系统的蛋白组参考图，共鉴定蛋白点936个，代表了839个单一蛋白，占理论蛋白组（3859个预测蛋白）的21.7％。结合基因组注释信息，我们利用KEGG代谢途径数据库，重建了H.hispanica PHA合成相关的代谢途径。该菌中的PHA生物合成途径类似于细菌中的经典途径，即由β-酮硫解酶(β-ketothiolase，PhaA)、乙酰乙酰-CoA还原酶(acetoacetyl-CoA reductase，PhaB)和PHA合酶(PHA synthase，PhaEC)三个酶的催化完成。比较蛋白组和转录组分析结果表明，在营养限制培养条件下（PHA积累条件下），随着TCA循环和呼吸链的抑制，乙酰-CoA更多的流入PHA生物合成途径，胞内开始积累PHA。相应地，PHA合成相关基因phaEC，phaB，和phaP均上调表达。PHA生物合成过程中所需的大量还原力NADPH由C3（丙酮酸）和C4（苹果酸）途径偶联尿素循环过程共同供给。当PHA生物合成途径被阻断(本实验的PHA合酶基因敲除突变体ΔphaEC)，同样在PHA积累条件下培养，ΔphaEC突变体将多余的碳源和能源消耗在激活的TCA循环中，对生物量的积累影响很小。 综上所述，互为补充的蛋白组学和转录组学分析方法的应用，加深了我们对嗜盐古菌PHA生物合成途径及其可能的调控机制的理解和认识，初步揭示了PHA代谢与中心代谢途径之间的协调和联系。据我们所知，这是第一个在组学水平针对嗜盐古菌PHA合成及调控机制的探索，进一步系统的分析和代谢工程改造，将为嗜盐古菌PHA的生产提供理论依据。