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目的:在酿酒酵母全基因组缺失库中筛选组蛋白H3K23氨甲酰化修饰酶,并对候选基因进行验证,从而进一步研究赖氨酸氨甲酰化的功能和分子调控机制,为相关疾病提供新思路。方法:1.免疫印迹法鉴定组蛋白H3K23氨甲酰化位点特异性抗体。2.从实验耗材、耗时、免疫印迹技术检测组蛋白H3K23氨甲酰化水平方面比较酵母裂解酶法和酸洗玻璃微珠法筛选的可行性。3.利用免疫印迹法进行酿酒酵母全基因组缺失库组蛋白H3K23氨甲酰化修饰酶的第一轮筛选。4.利用生物信息学方法对245个影响氨甲酰化修饰基因进行KEGG功能注释分析。5.利用免疫印迹法进行245个影响氨甲酰化修饰基因的第二轮筛选。6.免疫印迹法检测差异氨基酸培养基对组蛋白H3K23位点氨甲酰化的影响。7.免疫印迹法检测测组蛋白去乙酰化酶抑制剂对酿洒酵母组蛋白H3K23氨甲酰化的影响。8.免疫印迹法检测量蛋白合成抑制剂对酿酒酵母组蛋白H3K23氨甲酰化的影响。9.免疫印迹法探究酿酒酵母组蛋白H3K23氨甲酰化修饰酶降解的途径。10.分子克隆构建组蛋白H3K23氨甲酰化修饰酶候选基因表达载体及酵母转化法构建相应过表达酿酒酵母菌株。11.免疫印迹法检测过表达候选基因酿酒酵母菌株组蛋白H3K23氨甲酰化水平。结果:1.H3K23氨甲酰化的位点特异性抗体可以特异性识别酿酒酵母组蛋白H3的K23位修饰。2.从实验成本、耗时等众多方面考虑,酸洗玻璃微珠法更适合本课题进行酿酒酵母全基因组范围内组蛋白H3K23氨甲酰化修饰酶的筛选。3.通过第一轮筛选我们共得到36个氨甲酰化水平增强的基因和209个氨甲酰化水平降低的基因。4.对245个影响组蛋白H3K23氨甲酰化修饰基因进行KEGG富集分析发现吞噬作用、RNA降解、mRNA检测、氧化磷酸化功能显著富集。5.通过第二轮筛选我们得到49个影响组蛋白H3K23氨甲酰化修饰的基因。6.免疫印迹法检测发现氨基酸缺陷型培养基抑制酿酒酵母细胞的生长和减少组蛋白H3K23氨甲酰化。7.免疫印迹法检测发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂对酿酒酵母组蛋白H3K23氨甲酰化无交叉调节。8.免疫印迹法检测发现酿酒酵母组蛋白H3K23氨甲酰化修饰酶不通过泛素化途径降解。9.免疫印迹法检测发现酿酒酵母组蛋白H3K23氨甲酰化修饰酶不通过自噬途径降解。10.分子克隆成功构建 LSM7、MRP10、ADA2、SPT6、SPT16、SPT5、SPT10、TRM1、LSM1表达载体。野生型酵母细胞(BY4742)转化各组0.5 ug质粒1h后,放在CSH-URA琼脂培养基上筛选2天,经挑取单克隆和单克隆扩大培养及鉴定,得到目标酵母菌株。11.免疫印迹法检测发现酿酒酵母过表达LSM7、LSM1、ADA2、SPT6菌株组蛋白H3K23氨甲酰化水平降低,酿酒酵母过表达SPT16菌株组蛋白H3K23氨甲酰化水平升高,酿酒酵母过表达SPT5、SPT10、TRM1、MRP10菌株组蛋白H3K23氨甲酰化水平无影响。结论:在缺陷型氨基酸培养条件下,酿酒酵母细胞的生长被抑制,组蛋白H3K23氨甲酰化水平降低。酿酒酵母组蛋白H3K23氨甲酰化修饰酶不通过泛素化和自噬降解。LSM7、LSM1、ADA2、SPT6、SPT16参与酿酒酵母组蛋白H3K23氨甲酰化的调控。