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目的:结肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，主要好发于40到50岁年龄组，发病率居胃肠道肿瘤的第三位，尤其在发达国家的发病率和死亡率极高。随着我国人民生活水平的提高，饮食结构发生了很大变化，致使结肠癌的发病率也日趋增高。目前结肠癌的发病机制尚不清楚，是提高结肠癌治疗效果的一个阻碍，因此本论文将结肠癌作为研究对象。传统的肿瘤治疗方法有很多种，如化学治疗、物理治疗、手术治疗等，但是欲进一步改善患者的预后，还需寻找新的治疗方法。肿瘤基因治疗是一种新的肿瘤治疗方法，即把外源基因导入某种细胞，进而将该细胞接种到荷瘤个体中，通过不断合成外源基因编码的蛋白而在体内发挥相应的功能，最终达到抑制甚至清除肿瘤细胞的目的。肿瘤基因治疗的目的基因包括细胞因子、抗癌基因、肿瘤药物相关基因等。细胞因子作为一种具有重要免疫调节功能的小分子蛋白质，在肿瘤基因治疗中具有重要地位，目前，已有多种细胞因子作为候选者进行了研究，其中IL-17作为Th17细胞的特征性细胞因子引起了我们的兴趣。细胞因子IL-17是辅助性T淋巴细胞亚群（Th17）所分泌的一种细胞因子，在炎症性疾病及自身免疫性疾病中起重要的作用，可以促进前炎症因子的释放，属于一种促炎细胞因子。目前的研究资料显示，IL-17在肿瘤的发生发展中具有重要作用，但是IL-17发挥抗肿瘤作用还是促肿瘤作用还存在争议。因此，本论文拟建立稳定转染IL-17基因的小鼠结肠癌细胞C26，并建立动物模型，对IL-17在结肠癌发生发展中的作用进行研究。方法:1构建稳转C26/pcDNA3.1和C26/IL-17细胞株并进行鉴定体外培养小鼠C26细胞，采用脂质体转染的方法将携带IL-17基因的pcDNA3.1载体转染小鼠结肠癌细胞C26，同时将pcDNA3.1空载体转染C26细胞作为对照组细胞，经G418筛选和有限稀释法获得稳定表达IL-17蛋白的C26细胞（C26/IL-17）。普通PCR法鉴定C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三种细胞中IL-17基因的表达，免疫荧光法鉴定三种细胞中IL-17蛋白的表达。2划痕修复实验检测细胞的迁移能力在24孔板中培养C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17细胞，当细胞生长达到80%到90%融合度时，用10μl的枪头划痕，用PBS洗去漂浮的细胞，然后再加入4%FCS完全1640培养液继续培养，在0h、24h分别在倒置显微镜下观察并拍照，检测划痕宽度的变化。迁移率=（划痕初始宽度－目前宽度）/2/划痕初始宽度×100%。3检测细胞体外增殖能力MTS法检测C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三种细胞体外增殖的情况，并绘制增殖曲线。4构建荷瘤小鼠动物模型将C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三种细胞分别接种于小鼠背部皮下，每组20只，雌雄各半，观察三组荷瘤小鼠体内肿瘤大小生长情况、小鼠生存期变化情况。5荷瘤小鼠脾细胞增殖情况检测荷瘤小鼠接种肿瘤细胞5周后，分别取各组小鼠脾脏，利用密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，采用MTS法检测各组小鼠脾细胞增殖反应，并绘制增殖曲线。6荷瘤小鼠脾NK细胞杀伤活性检测荷瘤小鼠接种肿瘤细胞5周后，分别取各组小鼠脾脏，密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，采用MTS法检测各组小鼠脾NK细胞杀伤活性（效靶比分别为40:1，20:1，10:1）。7荷瘤小鼠脾细胞中Th1,Th2,Th17,Treg细胞特征性因子的表达情况检测荷瘤小鼠接种肿瘤细胞5周后，分别取各组小鼠脾脏，密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，Real-Time PCR法检测小鼠脾淋巴细胞中Th1、Th2、Th17、Treg细胞特征性细胞因子和/或转录因子的表达。8荷瘤小鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）增殖情况检测荷瘤小鼠接种肿瘤细胞5周后，分别取各组小鼠肿瘤组织，过滤法和密度梯度离心法分离TIL，采用MTS法检测各组小鼠TIL的增殖反应情况，并绘制增殖曲线。9小鼠肿瘤浸润巨噬细胞种类鉴定Real-Time PCR法检测各组荷瘤小鼠肿瘤浸润巨噬细胞中M1特征性细胞因子IL-10和M2特征性细胞因子IL-12的表达。结果：1构建稳转细胞株以pcDNA3.1质粒为载体将IL-17基因成功转染至小鼠结肠癌细胞，建立高表达IL-17的细胞株C26/IL-17。显微镜下观察证实三种细胞形态没有明显变化；普通PCR结果显示C26/IL-17细胞有IL-17基因的高表达，其他两种细胞中仅见IL-17的微弱表达；免疫荧光检测显示C26/IL-17细胞有IL-17蛋白的表达，而C26、C26/pcDNA3.1细胞未见IL-17蛋白的表达。2划痕修复实验检测细胞的迁移能力划痕修复实验检测结果显示C26/IL-17较C26、C26/pcDNA3.1细胞迁移能力增强（P<0.05）。3MTS法检测三种细胞的体外增殖情况结果显示C26/IL-17较C26、C26/pcDNA3.1细胞增殖能力明显降低（P<0.05）。4构建小鼠荷瘤动物模型将C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三种细胞分别接种于小鼠背部皮下后，第七天可以摸到皮下肿瘤，从第十四天开始，每隔一天测量小鼠肿瘤大小。结果显示，接种C26/IL-17细胞的小鼠的移植瘤体积明显小于接种C26和C26/pcDNA3.1细胞的小鼠移植瘤体积（P<0.05）；接种C26和C26/pcDNA3.1细胞的小鼠移植瘤体积间无统计学差异（P>0.05）。并且接种C26/IL-17细胞的雄性小鼠移植瘤明显小于雌性小鼠移植瘤体积（P<0.05），而接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的雌雄小鼠移植瘤大小之间没有统计学差异（P>0.05）。生存期结果显示各组小鼠生存期之间均无明显统计学差异（P>0.05）。5荷瘤小鼠脾细胞增殖情况检测MTS法检测各组小鼠脾细胞增殖反应结果显示性别因素对荷瘤小鼠脾细胞的增殖无影响（P>0.05）。各组间两两比较显示接种C26/IL-17细胞的小鼠脾细胞较接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠脾细胞增殖能力强（P<0.05），与正常小鼠脾细胞增殖能力比较无明显统计学差异（P>0.05）；接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠脾细胞增殖能力较正常小鼠脾细胞增殖能力降低（P<0.05）；接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠脾细胞增殖能力无统计学差异（P>0.05）。6荷瘤小鼠脾NK细胞杀伤活性检测NK细胞杀伤活性检测结果显示性别因素对荷瘤小鼠脾NK细胞杀伤活性无影响（P>0.05）。各组间两两比较结果显示在效靶比为40:1和20:1时，接种三种细胞的小鼠NK杀伤率较正常小鼠均降低（P<0.05）；在效靶比40:1时，接种C26/IL-17细胞比接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠的脾淋巴细胞的NK杀伤率明显增强（P<0.05）；效靶比10:1时，各组之间没有明显统计学差异（P>0.05）；在效靶比40:1、20:1和10:1时，接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠脾NK细胞杀伤率均无统计学差异（P>0.05）。7荷瘤小鼠脾细胞中Th1,Th2,Th17,Treg细胞特征性因子的表达情况检测Real-Time PCR法检测结果显示，性别因素对此处结果无影响。接种C26/IL-17细胞的小鼠脾淋巴细胞较接种C26、C26/pcDNA3.1的表达更高水平的IFN-γ(Th1特征性细胞因子)、IL-4(Th2特征性细胞因子)、GATA-3(Th2特征性转录因子)、ROR-γt(Th17特征性转录因子)、IL-10（Treg特征性细胞因子）mRNA(P<0.05)；接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠脾淋巴细胞表达IFN-γ、IL-4、GATA-3、ROR-γt、IL-10mRNA的水平无统计学差异(P>0.05)。8荷瘤小鼠肿瘤浸润的淋巴细胞（TIL）增殖情况检测MTS法检测各组荷瘤小鼠TIL的增殖反应结果显示，性别因素对TIL增殖能力无影响（P>0.05）。各组间两两比较显示接种C26/IL-17细胞的小鼠TIL较接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠TIL增殖能力强（P<0.05）；接种三种细胞的小鼠TIL增殖能力较正常组小鼠均降低（P<0.05）；接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠TIL增殖能力无统计学差异（P>0.05）。9小鼠肿瘤浸润巨噬细胞种类鉴定Real-Time PCR法检测各组荷瘤小鼠肿瘤浸润巨噬细胞中IL-10和IL-12mRNA表达结果显示，性别因素对本指标无影响，IL-10和IL-12mRNA表达在各组荷瘤小鼠之间均无统计学差异（P>0.05）。结论：1成功构建稳定转染IL-17基因小鼠结肠癌细胞株（C26/IL-17）。转染IL-17基因对细胞形态没有明显影响，可以使细胞体外增殖减慢，细胞迁移能力增强。2成功建立了小鼠结肠癌模型，转染IL-17基因可以抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，增强小鼠脾细胞增殖能力和NK细胞杀伤活性，可使小鼠脾细胞中Th1、Th2、Th17、Treg细胞分泌特征性因子增多。促进小鼠肿瘤浸润的淋巴细胞增殖。3IL-17高表达对雄性小鼠结肠癌肿瘤生长的抑制作用更强。