【摘 要】
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该论文工作主要集中在三个新的RB结合蛋白编码基因的克隆和初步的功能研究上,利用酵母双杂交系统,我们用含有完整的口袋区域的RBC端片段(377-928aa)筛选到5个新的RB结合蛋白
【出 处】
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中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 中国科学院上海生命科学研究院
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该论文工作主要集中在三个新的RB结合蛋白编码基因的克隆和初步的功能研究上,利用酵母双杂交系统,我们用含有完整的口袋区域的RBC端片段(377-928aa)筛选到5个新的RB结合蛋白编码基因,并对其中3个基因进行了进一步的研究.我们对克隆到的新基因及其编码蛋白产物的基本特性进行了分析:Northern杂交结果表明这几个基因在多种人体正常组织和一些肿瘤细胞株中都有广泛的表达;用StanfordG3RHpanel的辐射杂交细胞系试验盒对这几个基因进行了染色体定位位;在HeLa或COS-7细胞中瞬时表达GFP融合蛋白,通过观察绿色荧光信号确定了这些基因编码产物的亚细胞定位.通过体外翻译和免疫共沉淀实验在体外证实了这几个蛋白因子与RB之间的特异性结合,并且它们与RB的体内结合也在用转染的哺乳动物细胞裂解物进行的免疫共沉淀实验中得到进一步的确证.我们还构建了一系列RB及RB结合蛋白的突变体,以确定它们结合的确切位点.为了研究这些基因的表达结细胞生长和增殖的影响,我们在多种细胞株中进行了集落形成实验,并利用流式细胞技术MTT比色实验对瞬时转染RBP95和RBp21的细胞凋亡情况和细胞生存能力进行了检测,发现RBP95和RBP21的过量表达具有不同程度的致凋亡作用,且破坏RBP95与RB之间的相互作用的突变体和丧失二聚化能力的RBP95突变体在过量表达时的至凋亡能力与野生型相比较明显减弱.破坏RBP21和RB之间的相互作用同样会降低Rbp21的致凋亡能力.该论文工作为将来进一步研究这些RB结合蛋白的生理功能,以及它们以RB之间结合的重要性打下了基础.
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