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黄连素(Berberine，[C20H18NO4]，又称小檗碱)是从毛莨科植物黄连(Coptidis rhizoma，CR)、黄柏(Cortex phellodendri)根茎中提取出的一种异喹啉类生物碱。既往研究证实：黄连素具有降低血糖、调节血脂、改善胰岛素抵抗、抗炎、抗氧化、抑制醛糖还原酶等药理作用，显示黄连素作为防治DM及其并发症用药具有一定的临床价值和应用前景。本文的前期研究发现黄连素能明显改善DM肾损伤模型动物的肾功能，抑制肾脏肥大、减少蛋白尿；体外实验研究表明黄连素可以抑制高糖培养的大鼠GMC增殖和ECM积聚，然其分子作用机理尚不十分清楚。鉴于NF-κB的激活及下游炎症因子的表达在DN的病理发展过程中起十分重要作用，黄连素是否能通过抑制NF-κB信号通路及其下游炎症因子的表达以减轻肾脏炎性反应、改善ECM积聚、发挥抗DN的综合效应?值得探讨、研究。
本文前期动物实验研究表明，黄连素对实验性DN模型具有较好的肾功能保护作用。研究中发现，黄连素可以减少DN模型肾组织中IκB-α的降解和肾小球细胞核内NF-κB p65的阳性表达，下调ICAM-1，TGF-β1和ECM成分FN的表达。提示DN模型中肾组织NF-κB信号通路被激活，黄连素抗DN作用可能与其抑制NF-κB炎症信号通路的激活密切相关。然在整体动物模型上，这种作用不排除黄连素降糖作用的间接效应，需进一步明确黄连素不依赖其降糖效应、相对特异性的抑制肾固有细胞NF-κB激活而发挥抗DN效应的机制。因此本研究中采用炎性刺激脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激的而非高糖培养的大鼠GMC作为研究对象，观察黄连素对其NF-κB信号通路及其下游炎症因子ICAM-1、iNOS的影响。
目的：
1.观察黄连素对LPS刺激的大鼠GMC增殖及ECM的主要成分---FN蛋白表达的影响。
2.观察黄连素对LPS刺激的大鼠GMC NF-κB炎性信号通路及其下游炎症因子ICAM-1、iNOS蛋白表达的影响，以深入研究黄连素抗DN炎性损伤的分子机制。
方法：本课题组自行分离、培养、鉴定、稳定传代的SD大鼠GMC，常规培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃，饱和湿度，5％CO2的细胞培养箱中培养。每2-3天用含0.25％的胰酶消化传代。
1.实验分组1)正常对照组(NG)2)细胞炎症模型组(100 ng/ml LPS，LPS)3)黄连素低剂量(10 μM BBR+100 ng/ml LPS，BL)4)黄连素中剂量(30 μM BBR+100 ng/ml LPS，BM)5)黄连素高剂量(90 μM BBR+100 ng/ml LPS，BH)6)NF-κB抑制剂组(100 μM PDTC+100 ng/ml LPS，PDTC)实验用超纯水作为溶媒溶解黄连素，用PBS作为溶媒溶解PDTC。
2.MTT比色法检测黄连素预干预对LPS处理24 h大鼠GMC细胞活力的影响。
3.Western Blot检测黄连素预干预对LPS处理30 min，12h和24h大鼠GMCNF-κB p65、IκB-α，ICAM-1、iNOS和FN蛋白表达的影响。
4.免疫荧光染色、激光共聚焦观察黄连素预干预对LPS处理30 min大鼠GMCNF-κB p65核转位的影响。
5.亚硝酸酶法试剂盒检测黄连素预干预对LPS处理24 h大鼠GMC细胞培养液中NO代谢产物NO2-+NO3-的含量变化来反映GMC NO的分泌情况。
结果:
1.黄连素预干预对LPS刺激的大鼠GMC细胞活力的影响。MTT法观察细胞活力的变化，结果发现终浓度为100 ng/ml的LPS处理24 h可以明显促进大鼠GMC增殖(P＜0.05)；黄连素预干预12 h后与LPS同处理24h能够剂量依赖性的抑制LPS诱导的大鼠GMC增殖(P＜0.05)；其中90μM的剂量达到较理想的抑制效应，最后选择10，30，90μM三个剂量进行实验；而用黄连素对未加LPS刺激的大鼠GMC进行干预36 h，结果发现10-90μM的黄连素对正常培养的大鼠GMC的细胞活力没有明显的影响，说明本文选的三个剂量对细胞是没有毒性的；100 μM的NF-κB特异性抑制剂PDTC能显著抑制LPS诱导的大鼠GMC增殖(P＜0.05)。
2.黄连素预干预对LPS刺激的大鼠GMC FN蛋白表达的影响。LPS可显著诱导肾小球系膜FN的蛋白表达上调，与正常组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)；黄连素各剂量预干预组、PDTC组对LPS诱导的GMCFN蛋白表达增加具有一定的抑制作用，尤以黄连素中、高剂量组和PDTC组作用明显，与LPS组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示黄连素具有抑制LPS诱导的GMC FN蛋白表达的作用。
3.黄连素预干预对LPS刺激的大鼠GMC NF-κB激活的影响。
3.1 Western Blot结果显示：LPS刺激30 min可明显诱导GMC细胞核中NF-κBp65的蛋白表达增加、细胞浆中NF-κB p65的蛋白表达减少，与正常组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)；黄连素各剂量预干预组、PDTC组与模型组相比，胞核中NF-κB p65的蛋白表达减少、胞浆中NF-κB p65蛋白表达增加，以黄连素中、高剂量组及PDTC组作用显著，与LPS组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示黄连素具有抑制细胞浆中NF-κB p65向细胞核转位的作用，并呈一定的量效依赖关系。
3.2 IκB-α是NF-κB的抑制性蛋白，胞浆中IκB-α的磷酸化降解可促进NF-κB p65的核转位。LPS刺激30 min即可引起GMC胞浆中IκB-α蛋白的降解，与正常组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)；黄连素各剂量预干预组、PDTC组对LPS诱导的GMC胞浆IκB-α蛋白的降解具有一定的抑制作用，尤以黄连素中、高剂量组和PDTC组作用显著，与LPS组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。实验结果与胞浆/胞核p65的蛋白表达结果相吻合，提示黄连素通过抑制IκB-α的降解、减少p65的转位入核，从而抑制NF-κB的激活。
3.3 免疫荧光染色，激光共聚焦定位观察可见：正常对照组细胞核未见NF-κB p65的荧光染色；经LPS刺激30 min后，LPS刺激组细胞核密布NF-κB p65的荧光染色；黄连素预干预组细胞核散在NF-κB p65荧光染色;PDTC组细胞核极少见NF-κB p65的荧光染色。免疫荧光染色，激光共聚焦观察佐证了黄连素具有抑制LPS刺激的GMC NF-κB p65核转位的作用。
4.黄连素预干预对LPS刺激的大鼠GMC炎症因子表达的影响。
4.1 黄连素预干预对LPS刺激的大鼠GMC ICAM-1蛋白表达的影响LPS干预12 h即可显著诱导GMC ICAM-1的蛋白表达上调，与正常组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)；黄连素各剂量预干预组、PDTC组对LPS诱导的GMC ICAM-1蛋白表达增加具有一定的抑制作用，尤以黄连素中、高剂量组和PDTC组作用明显，与LPS组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示黄连素具有抑制LPS诱导的GMC的炎症粘附分子ICAM-1蛋白表达的作用。
4.2 黄连素预干预对LPS刺激的大鼠GMC iNOS蛋白表达的影响正常状态下，GMC几乎不表达iNOS蛋白，LPS干预12 h即可显著诱导GMC iNOS的蛋白表达上调，与正常组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)；黄连素各剂量预干预组、PDTC组对LPS诱导的GMC iNOS蛋白表达具有一定的抑制作用，尤以黄连素中、高剂量组和PDTC组抑制作用明显，与LPS组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示黄连素具有抑制LPS诱导的GMC炎性酶iNOS蛋白表达的作用。
5.黄连素预干预对LPS刺激的大鼠GMC NO生成的影响。一氧化氮的半衰期极短，无法直接检测NO的生成量，因此检测细胞培养液中NO代谢产物NO2-+NO3-的含量变化来反映NO的变化情况。LPS处理24 h可引起细胞培养液中NO2-+NO3-含量显著升高，与正常对照组比差异具有统计学意义(P＜0.05)；黄连素各剂量预干预组、PDTC组对LPS诱导的GMCNO分泌增加具有一定的抑制作用，尤以黄连素中、高剂量组和PDTC组抑制作用明显，与LPS组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示黄连素在抑制LPS诱导的GMC炎性酶iNOS蛋白表达的基础上，具有明显抑制NO生成增加的作用。
结论：LPS能显著诱导大鼠GMC增殖与FN蛋白高表达，激活大鼠GMC NF-κB信号通路及其下游炎性黏附因子ICAM-1、炎性酶iNOS的蛋白表达；黄连素预干预能够显著抑制LPS诱导的大鼠GMC增殖与FN蛋白的高表达，这与抑制NF-κB信号通路的激活，下调ICAM-1的蛋白表达，减少iNOS及其产物NO的生成关系密切。提示：黄连素的抗DN作用可能与不依赖其降糖效应的抑制GMCNF-κB炎症信号通路的激活及其下游炎性介质的表达，从而改善GMC增殖，减少ECM成分FN的表达相关联。该作用可能是黄连素改善DN炎症损伤，发挥抗DN作用的重要机制。