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研究目的:验证USP4与TGFβRI能否发生相互作用;检测USP4对TGFβRI的泛素化修饰;检测TGF-β信号通路活化后EMT标志分子的变化;探讨USP4蛋白表达对乳腺癌细胞生物学活性的影响;探讨USP39蛋白表达对乳腺癌细胞生物学活性的影响。研究方法:通过免疫共沉淀实验探究USP4与TGFβRI在细胞内的相互作用。通过重组慢病毒感染,构建稳定过表达USP4、稳定干扰USP4的乳腺癌细胞系。通过泛素化实验检测过表达USP4及干扰USP4对TGFβRI泛素化水平的影响。通过Western blot检测TGF-β信号通路活化后乳腺癌细胞EMT标志分子的表达量变化。通过划痕实验、细胞克隆形成实验、CCK-8实验探究过表达USP4对乳腺癌细胞生物学活性的影响。通过划痕实验、细胞克隆形成实验、CCK-8实验探究在过表达USP4的基础上再过表达USP39对乳腺癌细胞生物学活性的影响。实验结果:在BT-549细胞中过表达带有Flag标签的USP4,进行CO-IP实验证实TGFβRI和USP4发生了免疫共沉淀,二者可以在体内发生相互作用。经重组慢病毒感染成功构建稳定过表达USP4、稳定干扰USP4的乳腺癌BT-549细胞系。经荧光定量PCR和Western blot检验,稳定过表达USP4的BT-549细胞系中USP4 mRNA的表达量是对照细胞的14.22倍,蛋白的表达量是对照细胞的4.99倍;稳定干扰USP4的BT-549细胞系中USP4 mRNA的干扰效率可达82%,USP4蛋白的表达量也明显低于对照细胞。在乳腺癌BT-549细胞中,USP4可以对TGFβRI的进行泛素化修饰。过表达USP4可以使TGFβRI的泛素化水平降低,干扰USP4可以使TGFβRI的泛素化水平提高。使用TGFβ1诱导过表达USP4的BT-549细胞和空白对照BT-549细胞,两种细胞均可发生EMT的形态转变,且过表达USP4的BT-549细胞的EMT变化趋势更明显。经诱导后,间充质表型标志蛋白N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Slug蛋白表达均上调,上皮表型标志蛋白ZO-1蛋白表达量下调,且过表达USP4的BT-549细胞EMT标记分子的蛋白表达量变化更明显。稳定过表达USP4的BT-549细胞的迁移能力、克隆形成能力、增殖能力均强于对照病毒感染的BT-549细胞和空白对照BT-549细胞,且差异具有统计学意义。在过表达USP4基础上再过表达USP39的BT-549细胞的迁移能力、克隆形成能力、增殖能力均强于只过表达USP4和空白对照BT-549细胞,且差异具有统计学意义。结论:TGFβRI和USP4可以在体内发生相互作用。在乳腺癌BT-549细胞中,USP4可以对TGFβRI的进行泛素化修饰。过表达USP4可使TGFβRI的泛素化水平降低,干扰USP4可使TGFβRI的泛素化水平提高。TGFβ1诱导可激活BT-549细胞的TGF-β信号通路,过表达USP4可进一步增强TGF-β信号通路活性,促进乳腺癌细胞发生EMT。过表达USP4可以增强乳腺癌BT-549细胞的生物学活性。在过表达USP4基础上再过表达USP39可进一步增强乳腺癌BT-549细胞的的生物学活性。