【摘 要】
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猪链球菌2型是一种重要的人畜共患病病原,罹患猪链球菌病的机体往往表现出脑膜炎、心内膜炎、关节炎等症状。近年来中国爆发的两次较大规模猪链球菌感染疫情中,造成了数百人
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猪链球菌2型是一种重要的人畜共患病病原,罹患猪链球菌病的机体往往表现出脑膜炎、心内膜炎、关节炎等症状。近年来中国爆发的两次较大规模猪链球菌感染疫情中,造成了数百人次的感染和数十人死亡,给养猪业和人民财产安全造成了较大威胁。有研究表明猪链球菌在早期感染过程中会定植于宿主的扁桃体内,继而引起宿主产生较强的炎性反应,主要表现为相关炎性细胞因子的上调表达。大量炎性介质的产生也被认为是导致宿主感染早期迅速死亡的原因之一。目前公认的观点是猪链球菌通黏附膜上皮细胞来逃避宿主的免疫识别,但其究竟如何突破宿主的第一道免疫防线而致病的,目前尚无确切阐述机制。本课题通过对实验室前期筛选得到的一个致炎蛋白展开研究,将该蛋白命名为HP1330,该蛋白是一种依赖金属离子的基质金属蛋白酶,通过水解细胞基质发挥活性。希望通过对其致炎机制的研究,为解释猪链球菌感染机体后导致的炎性紊乱提供一定的支持依据,也为今后针对该病的防治提供一定的理论基础。该蛋白尚未见文献报道,本实验的主要研究内容如下:(1)通过对实验室早期筛选出的HP1330进行研究,首次发现HP1330能够显著刺激RAW264.7细胞IL-1、MCP-1、TNFα、IFNβ等细胞因子的上调表达。并且通过荧光定量PCR和Elisa进一步验证了 HP1330的促炎活性。(2)特异性相关信号通路抑制剂的抑制实验发现HP1330主要通过ERK、NF-kB、和P38途径来调控TNFα、MCP-1、IL-1的上调表达,并且通过TLR受体抑制实验发现HP1330发挥其促炎活性主要是通过TLR4实现的。(3)为进一步确定其促炎活性,在本实验中构建了 HP1330的缺失菌株△1330,通过对RAW264.7细胞和BALB/C小鼠的模型实验,进一步验证了 HP1330显著的促炎功能。(4)通过对△1330和SC19的革兰氏染色实验,发现了二者链长存在较大差异,通过对不同OD值下△1330和SC19革兰氏染色镜检进一步确定了其差异,并通过BLAST分析和酶活实验,发现HP1330作为基质金属蛋白酶可以和细胞壁的主要成分肽聚糖相互作用,推测由于△1330缺少了 HP1330导致其细胞膜外成分不能被有效水解,导致其链长增长,从而更容易被宿主识别并清除。结合上述结果,推测HP1330的底物可能是肽聚糖。
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