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雄激素性秃发(Androgenic alopecia,AGA),又称脂溢性脱发、男性型脱发,属中医学"发蛀脱发"、"蛀发癣"范畴,是皮肤科临床的常见病、多发病,也是难治性疾病之一,该病病程漫长且顽固难愈。目前AGA的病因及发病机制尚不明确,一般认为雄激素及其受体的表达在本病的发生中起关键作用,而Ⅱ型5α-还原酶是其发病的重要因素。研究认为,雄激素(睾酮)在Ⅱ型5α-还原酶作用下转化为活性更强的双氢睾酮(Dihydrotestosterone,DHT),双氢睾酮与其受体结合后进一步诱导TGF-β2表达,TGF-β2是毛发生长的负调控因子,可导致毛发生长期缩短,提前进入休止期,从而引起脱发。此外,TGF-β2还能够促进caspase3和caspase9的表达,影响Bcl-2/Bax比率,引起细胞(如毛乳头细胞)线粒体凋亡。目前国内经国家食品药品监督管理局(SFDA)批准的用于治疗男性AGA的口服药物主要是非那雄胺片。该药虽广泛应用于临床,但不能完全阻断病程进展,且存在不同程度的不良反应。锯叶棕(Sawpalmetto),又名沙巴棕,是生长于美国东南部一种常见的棕榈科灌木,其果实提取物富含油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、亚油酸等,是目前广泛应用于治疗前列腺增生的天然植物制剂。现代研究发现,锯叶棕果实提取物(Sawpalmetto extracts,SPE)具有非竞争性抑制5α-还原酶活性(Ⅰ型和Ⅱ型)、抑制双氢睾酮与其受体结合、抗炎及抗凋亡等药理作用,而其是否具有促毛发生长的作用尚未见报道。基于AGA与前列腺增生的发病均与雄激素和ⅡⅡ型5α-还原酶相关,本研究以非那雄胺作参比,观察锯叶棕果实提取物对人角质形成细胞和人毛乳头细胞存活的影响,同时构建雄激素性秃发小鼠模型,探索其是否具有促毛发生长作用,并初步探讨其相应的机制。研究内容:1.观察锯叶棕果实提取物对人角质形成细胞(human keratinocytes,HaCaTs)及人毛乳头细胞(human hair dermal papilla cells,HHDPCs)增殖的影响以及量效关系;2.建立雄激素性秃发小鼠模型,并进行分组实验处理,观察锯叶棕果实提取物对小鼠毛发的促生长作用并初步探讨其机制。研究方法:1.细胞实验:常规培养HaCaTs和HHDPCs细胞,并进行分组给药:空白组:正常培养细胞,不予处理;双氢睾酮(DHT)组:加入0.03μg/mLDHT培养液;DHT+非那雄胺组:加入0.03μg/mL DHT + 0.08μg/mL非那雄胺培养液;DHT+SPE组:加入0.03μg/mL DHT +(1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)SPE 培养液。用 MTT法检测各组细胞增殖率。2.动物实验:2.1建立C57BL/6小鼠雄激素性秃发的动物模型,并随机分为四组,每组8只:空白对照组、双氢睾酮(DHT)组、DHT+非那雄胺组、DHT+SPE组;观察各组小鼠灌服给药后各个时期(第7、14、21、28、35天)毛发的生长情况并记录评分;2.2给药35天后,脱颈处死小鼠,取其背部脱毛区圆形皮片,手术刀刮取皮片上所有毛发并称重,记录各组小鼠毛发质量;2.3取部分圆形皮片进一步做组织切片,HE染色,计算各组生长期(A)、退行期(T)毛囊数量;2.4采用Western blot法分别检测四组圆形皮片组织中TGF-β2、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3蛋白的表达量。研究结果:1.DHT对HaCaTs细胞增殖的影响:DHT能够诱导HaCaTs凋亡,且随着培养时间的延长而增强。SPE和非那雄胺均能够抑制DHT诱导的HaCaTs凋亡,并促进其增殖。其中SPE呈浓度依赖性和时间依赖性,随着给药浓度的增加(≤1O0μg/mL)和培养时间的延长,其促进作用逐渐增强,在25μg/mL浓度时,开始优于非那雄胺,在1000μg/mL浓度时达到最强;而当SPE达到200μg/mL时,其促进HaCaTs增殖作用随着时间的延长而减弱。各实验组间存在统计学差异。2.DHT对HHDPCs细胞增殖的影响:DHT能够诱导HHDPCs凋亡,且随着培养时间的延长而增强。SPE和非那雄胺均能够抑制DHT诱导的HHDPCs凋亡,并促进其增殖。SPE在低浓度时(1μg/mL、5μg/mL)即表现出较强的促增殖作用,且均优于非那雄胺,差异有统计学意义。当浓度≥25μg/mL时,其促增殖作用逐渐减弱。3.C57BL/6小鼠雄激素性秃发模型的建立:C57BL/6小鼠脱毛区皮肤均呈现粉红色,毛发生长处于休止期,说明成功建立了 C57BL/6小鼠秃发模型。4.SPE对小鼠毛发生长的影响:空白对照组、非那雄胺组、SPE组小鼠在28天、35天毛发生长情况评分结果一致,但总的来说,空白对照组小鼠毛发生长相对最好,背部皮肤最早出现黑色(7天内),非那雄胺组次之(14天内),SPE组相对较差,皮肤出现黑色较晚(21天内)。而DHT组35天内未见新生毛发长出。毛发称重结果中,空白组和非那雄胺组接近,分别为41.38g和40.8g,SPE组17.95g,DHT组为0。取背部圆形皮片HE染色100X下毛囊计数发现,非那雄胺组和SPE组毛囊总数接近,分别为68和65,均明显高于空白组(48)和DHT组(33)。SPE组处于生长期毛囊计数与非那雄胺组接近,视野下各组毛囊分布较均匀。5.SPE 对 TGF-β2、cleaved caspase3、Bax、Bcl-2 的影响:Western blot 结果显示,细胞凋亡因子TGF-β2、cleaved caspase3、Bax在DHT组的表达量明显高于其它三组,依次是DHT组>SPE组>非那雄胺组>空白组;而细胞凋亡抑制因子Bcl-2的表达正好相反,在空白组最高,依次为空白组>非那雄胺组>SPE组>DHT组。结论:锯叶棕果实提取物能够促进毛发生长。与非那雄胺相比,其促进作用稍弱,起效相对较慢。其机制可能与抑制TGF-β2、cleaved caspase3、Bax,而促进Bcl-2的表达相关。