农杆菌介导的西瓜遗传转化体系的研究

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我国的西瓜年产量居世界首位,但因常规育种周期比较长,使西瓜的种质创新与新品种的提供无法满足市场需求。通过基因工程的方法来改良西瓜品质,已成为一种选育西瓜新品种的有效途径。近年随着对类胡萝卜素营养保健功能的广泛认识,越来越多的学者对西瓜瓤中类胡萝卜素组成及合成途径进行深入研究,以期通过转基因技术提高西瓜中类胡萝卜素的含量,并进行种质创新。本试验建立西瓜子叶组织培养体系和子叶遗传转化体系,正是为要开展西瓜类胡萝卜素基因工程及其代谢调控探究提供技术保障。试验以西瓜子叶为外植体,研究子叶苗龄、不同激素浓度对子叶诱导分化影响以及再生条件,建立西瓜子叶离体高效组织培养体系。然后用西瓜子叶作为受体,研究预培养、农杆菌侵染和共培养时间对抗性芽分化的影响,以及不同抗生素浓度对西瓜子叶生长情况的影响,建立农杆菌介导的PSY基因遗传转化体系。通过试验,取得以下结果:(1)建立了以西瓜子叶作为外植体的组织培养体系。通过对西瓜子叶组织培养几个关键因素的试验,发现本试验条件下适宜的培养条件为:子叶苗龄的适宜时间为4d,子叶苗龄较短和较长都不利于不定芽的分化,子叶在黑暗条件培养一段时间的分化率较高,适宜培养基为MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂和MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.5mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。(2)建立了农杆菌介导的西瓜子叶遗传转化体系。以4d苗龄的子叶为受体,研究不同侵染时间(15,30,45,60min)、预培养时间(2,3d)、共培养时间(2,3,4d)对抗性芽分化的影响,也研究了抗生素(Kan、Amp、Cef)对西瓜子叶生长情况的影响。试验发现75mg/L的Kan能够很好的筛选出抗性芽,两周之内,200mg/L的Amp和400mg/L的Cef能够较好的抑制农杆菌大量的繁殖。预培养时间2d为宜,菌液侵染15min,接入MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+Kan75mg/L+Amp200mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂,黑暗条件下共培养3d,然后接入MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+Kan75mg/L+Amp200mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂的筛选培养基上,在温度为25℃±2℃,2000lx12h/d光照条件下进行培养,30天左右获得抗性芽。(3)本试验最后共获得4株抗性植株,抗性植株经PCR检测,其中1株为阳性植株,其他3株为假阳性植株,初步认为外源基因PSY已经整合到西瓜基因组中。
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