【摘 要】
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多光子成像是一种重要的成像技术,以其对生物体无损伤、穿透深度大等特点广泛应用于对活体生物样品的观察。在波长选择方面,用1700-nm波段作为激发光的多光子成像可以减少生
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多光子成像是一种重要的成像技术,以其对生物体无损伤、穿透深度大等特点广泛应用于对活体生物样品的观察。在波长选择方面,用1700-nm波段作为激发光的多光子成像可以减少生物组织对光的散射效应,获得更大的成像深度。活体动物,例如小鼠的头骨高度散射,妨碍了传统波长(例如800nm等)对头骨细胞甚至是头骨下脑部进行多光子成像。例如,多光子脑成像往往需要进行开颅手术,可能会导致大脑出血以及在长期观测出现炎症等负面因素,从而影响实验结果。因此,如何对头骨中的细胞进行成像,以及如何避免开颅手术引入的不良影响,开发无需开颅的脑成像技术成为研究人员们关注的焦点。利用1700-nm波段激发光低散射特点,为实现对小鼠头骨细胞以及大脑的无损成像,本论文开展多光子头骨细胞及穿透头骨脑成像技术研究,观察到小鼠头骨中腔隙结构,穿透深度达到大脑下750μm,提供了无损脑成像技术。本论文工作内容如下:1.自参考测量多光子显微镜轴向色差及双焦面成像我们开发了一种自参考测量轴向色差的创新技术,实验中使用双色脉冲对样品进行双色三次谐波成像,可以精确测量多光子成像系统的轴向色差。在此基础上我们利用轴向色差,开发了双焦面成像技术,相比传统光学成像方法,可以减小成像时间,扩展成像应用。2.改进活体小鼠头骨样品的制备方法根据多光子成像的特点和需求,我们重新设计了一种小鼠头部固定方法。使用这种固定方法,可以简化手术过程,减少手术时间,提高实验效率和成功率。3.对头骨腔隙结构无标记成像利用1700-nm波段三光子荧光及三次谐波成像技术,结合开发的选择性组织间液标记技术,我们对活体小鼠头骨中的骨细胞进行成像,得到高分辨率的图像,观察到以往只能使用电镜观察到的头骨细胞“三明治”结构,并为穿透头骨成像奠定了初步实验基础。4.穿透头骨成像在上述头骨成像的基础上,实验中我们用量子点标记活体小鼠大脑血管进行穿透头骨成像。这种穿透头骨无损大脑的新成像方法,成像深度可穿透小鼠头骨直达大脑灰质,三次谐波成像深度达大脑表面下400μm,荧光标记血管成像深度达大脑表面下750μm,避免开颅造成的不利影响。综上,论文主要测量了多光子系统中的轴向色差,改进了小鼠头部固定手术,观察到活体小鼠头骨腔隙结构,穿透小鼠头骨成像深度达到约900μm。
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