论文部分内容阅读
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，亦称为B族链球菌(GBS)，可引起奶牛乳腺炎，新生儿败血症、脑膜炎和肺炎及鱼类脑膜炎，是一种人-畜-鱼共患的病原菌，宿主感染范围广泛。近年来，无乳链球菌已成为世界性、多地区、多个鱼类品种的主要病原菌。其对温水性鱼类的危害尤其严重，给全球水产养殖业带来巨大的经济损失。研究发现，鱼源无乳链球菌致病性和传染性极强，对鱼类的致死率可达100％，但其致病机制仍不甚清晰。课题组前期研究发现，无乳链球菌与巨噬细胞互作后可引起N-乙酰胞壁质酶nala及内肽酶pepO基因表达的上调。为进一步探讨nala及pepO基因在无乳链球菌致病机制上的作用，本研究在构建基因缺失株的基础上，研究了nala及pepO基因的功能。 1.无乳链球菌nala及pepO基因缺失株的构建 采用同源重组的方法，利用温敏型自杀质粒pSET4s及链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET2，分别构建了nala基因和pepO基因的缺失株及相应的互补株。经过常规PCR、基因测序，以及荧光定量PCR对缺失基因在野生株、基因缺失株及互补株中mRNA转录水平的检测，证明nala和pepO基因的缺失株及互补株构建成功。 2.无乳链球菌pepO基因缺失株的生物学特性分析 对pepO基因分析发现，该基因全长为1086bp，编码蛋白含361个氨基酸。将948bp的pepO功能区片段利用大肠杆菌进行原核表达，获得的蛋白为35.5kD。将纯化后的重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，ELISA和Western-blot试验证明其具有良好的抗原性。对pepO基因缺失株、互补株与野生株进行生物学特性分析发现，与野生株相比，pepO基因缺失株在生长特性、抗巨噬细胞的吞噬及胞内存活能力、对上皮细胞的黏附能力、刺激巨噬细胞分泌促炎性细胞因子的能力以及对斑马鱼的毒力等特性上，均未发生明显变化。有关内肽酶pepO基因的功能需要进一步研究。 3.无乳链球菌nala基因缺失株的生物学特性分析 为了探讨nala基因的功能，对nala基因缺失株与野生株进行生物学特性比较，包括生长特性、细菌形态、细菌自溶能力、对斑马鱼的半数致死量(LD50)、抗巨噬细胞吞噬及胞内存活能力、对上皮细胞的黏附能力，以及对巨噬细胞和上皮细胞的毒性作用等。结果发现，与野生株相比，nala基因缺失株在对数生长期的生长速度明显降低，但与野生株同时达到平台期;形成了更长的细菌链;自溶活性下降了62.5％;对HEp-2细胞的黏附能力显著升高;对斑马鱼的LD50上升了4倍。以上特性分析结果表明，nala参与了细菌生长、子细胞分离、细菌自溶以及影响细菌黏附，并在无乳链球菌致病过程中发挥重要的作用。