论文部分内容阅读
抗菌肽是一种广泛存在于生物体内的多肽，其分子量小、化学性质稳定。抗菌肽具有高效的抗细菌、抗肿瘤、抗真菌、抗寄生虫、抗病毒作用，其独特的作用机制使细菌不易产生耐药性，因而成为科学家关注热点。颗粒溶素（Granulysin，GNLY）和大多数抗菌肽一样，能够杀灭多种微生物以及寄生虫，参与机体内免疫应答，是机体天然免疫的重要组成。有关绵羊抗菌肽GNLY 研究内容较少，其基因在不同品种绵羊中是否存在差异尚不确定。 目的：为了分析不同品种绵羊抗菌肽GNLY基因的SNP多态性，对新疆地区萨福克羊、美利奴羊、湖羊三个品种GNLY 基因CDS 区测序，利用生物信息学方法预测GNLY二级结构，推测氨基酸序列变化与蛋白结构和功能的关系；人工合成几条基于GNLY基因的多肽，测定合成多肽体外抑菌等生物学活性；挑选体外活性较强的多肽对小鼠乳房炎模型的进行治疗，测定合成多肽在体内的作用，为研发动物用抗感染药物提供科学依据。方法：（1）、通过采集萨福克羊、美利奴羊、湖羊外周血并提取RNA，反转录为cDNA后进行PCR扩增，对PCR产物进行测序分析。利用GNLY 核苷酸序列推导出的氨基酸序列，再运用软件分析预测GNLY的二级结构，根据绵羊颗粒溶素GNLY 和其单核苷酸多态性基因的推导的氨基酸序列设计多肽，按照保留其两亲性的?-螺旋和LOOP结构的设计原则，选取不同长度的多肽序列，设计合成多肽G16、G22、GS16、GC16。（2）、通过径向扩散试验和MIC 试验检测合成多肽对大肠杆菌、沙门氏杆菌、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用；利用MTT 试验观察合成多肽对人食管癌细胞（EC109）、人肾癌细胞（X786-0）的抑制作用。（3）、通过兔红细胞溶血试验验证合成多肽GC16的毒性；取分娩后8-10天的昆明系小鼠随机等量分为4组，分别记为PBS对照组（即不治疗）、多肽GC16治疗组、抗生素AMP治疗组、空白对照组。除空白对照组，其余每只小鼠均注射金黄色葡萄球菌，8 h后分别用PBS、GC16、AMP 进行治疗。24 h后全部脱颈处死，取部分组织做病理切片观察，其余组织做CFU计数和TNF-α 检测。 结果：（1）、绵羊GNLY 的二级结构含有8个α-螺旋和6个LOOP 结构；根据测序结果分析，GNLY 基因在萨福克羊、美利奴羊、湖羊体内核苷酸序列、氨基酸序列略有差异，与Genbank 序列核苷酸同源性为91.85%、93.78%、92.35%，氨基酸同源性为93.15%、93.68%、92.47%。（2）、MIC 试验中浓度大于250μg/mL 的G16 对大肠杆菌、葡萄球菌有抑制作用；浓度大于15μg/mL 的GS16对大肠杆菌抑制作用明显，但对沙门氏杆菌、葡萄球菌以及金黄色葡萄球菌无明显的抑菌效果；浓度为62.5μg/mL 的GC16 对四种细菌均有抑制作用，其中，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较为突出；而G22 对四种细菌均无显著的抗菌效果；MTT 试验结果表明合成多肽G16、GS16 对癌细胞无抑制作用，G22 和GC16 对人食管癌细胞（EC109）、人肾癌细胞（X786-0）具有显著抑制作用，其中1 mg/mL G22 和1 mg/mL GC16 对EC109 生长抑制率分别为88.21%，57.21%，对X786-0 生长抑制率分别为96.37%和81.87%。（3）、溶血试验可知多肽对兔红细胞几乎没有毒性；动物试验中，观察PBS 治疗组病理切片发现有炎性细胞浸润、充血、出血，腺泡组织不完整，组织间隙有大量细胞团块，金黄色葡萄球菌CFU 计数和TNF-α 水平明显高于其他3组（P<0.05）；多肽治疗组和抗生素治疗组没有明显的病理变化，乳腺中含有少量乳汁，乳腺上皮细胞及脂肪细胞正常，间质中偶见个别淋巴细胞，乳腺组织结构基本完整，但是多肽治疗组CFU 计数和TNF-α 显著低于抗生素组（P<0.05）。 结论：研究显示GNLY 基因在不同品种绵羊中存在丰富的多态性，预测其二级结构含有8个α-螺旋和6个LOOP结构；合成GNLY 多肽在体外试验中对细菌和肿瘤细胞具有抑制活性，对小鼠乳腺炎模型治疗具有良好的效果，本研究为绵羊抗菌肽GNLY 作为备选抑菌药物的研发打下了基础。