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多年生黑麦草(Lolium perenne L.)是具有生长快、分蘖多、耐牧、成坪速度快等优点的高价值饲用牧草。但因其籽粒小、饱满度差,严重降低了种子收获指数和种子质量,是全球范围内长期制约规模化种子生产效率的重要因素。CRISPR/Cas9基因编辑技术能够实现对基因的定点编辑,可作为黑麦草通过基因工程手段进行种质创新的有力工具。然而,由于多年生黑麦草遗传转化体系尚不成熟且远远滞后于其他作物,为通过基因编辑对其进行定向改良带来困难。因此,建立高效遗传转化体系并通过CRISPR/Cas9技术对黑麦草种子产量潜力进行遗传改良,对于保证黑麦草种子生产和机械化收获均具有重要意义。本研究建立了新西兰多年生黑麦草品种NUI的愈伤组织诱导及再生体系,克隆了LpCKX1全长基因序列并构建了靶向LpCKX1的CRISPR/Cas9基因编辑载体。为验证编辑载体的效率,对黑麦草原生质体的制备及转化条件进行了优化。主要结果如下:1、多年生黑麦草愈伤组织的诱导及再生体系的建立采用多年生黑麦草NUI的成熟种子作外植体,建立了多年生黑麦草高效再生体系。其中横切种子处理在添加5 mg/L的2,4-D的诱导培养基上,愈伤组织诱导效果最好,可用作遗传转化的受体,而种子浸泡研磨处理诱导的愈伤组织却极易褐化且难以再生。愈伤组织在添加1 mg/L的6-BA的分化培养基上分化效果最好。2、多年生黑麦草LpCKX1基因序列的克隆提取多年生黑麦草NUI基因组DNA,根据实验室前期获得的LpCKX1基因片段序列设计PCR引物,分段克隆了LpCKX1基因序列,并通过序列拼接获得了LpCKX1基因全长序列。3、靶向LpCKX1基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建根据细胞分裂素氧化酶基因LpCKX1的基因组序列,在外显子区域选择符合载体构建的靶点,构建了5个靶向LpCKX1的CRISPR/Cas9编辑载体。4、多年生黑麦草原生质体制备及瞬时表达体系的建立通过设计正交实验对原生质体制备和转化条件进行优化,建立了原生质体制备及瞬时表达体系。最佳原生质体制备条件为纤维素酶浓度为1%、离析酶浓度为0.3%、甘露醇浓度为0.5 mol/L、酶解时间为4 h,最佳原生质体转化条件为原生质体浓度为2×10~6个/mL、质粒浓度为0.7μg/μL、转化时间为5 min、PEG4000浓度为40%。5、CRISPR/Cas9编辑载体活性检测将构建好的载体转入原生质体中进行瞬时表达,经T7核酸内切酶酶切验证靶向LpCKX1载体具有活性。Sanger测序结果表明其中一处靶点发生T-G替换突变。本研究结果不仅为深入开展多年生黑麦草的功能基因组学研究奠定了基础,对通过细胞融合和基因工程手段进行黑麦草种质创新方面也具有重要意义。