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背景人脑胶质瘤(Human glioma)是颅内最常见而难治的原发性肿瘤。胶质瘤的发病率居颅内肿瘤之首,在国内占35.26%～60.96%,其中恶性胶质瘤约占60%。此肿瘤大多生长在中枢神经系统深部,且呈浸润生长,与周围脑组织边界不清,所以目前临床上采用的手术切除术和放射疗法为主要治疗方法,但治疗效果欠佳,因此,寻找主要治疗方法以外的辅助治疗方案尤为迫切。近年来从分子生物学方面抑制神经胶质瘤的恶性进展成为新的可行方法。随着分子生物学的研究不断深入,尤其是小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)及microRNA的发现,为肿瘤的基因治疗提供了广阔的发展空间。微小RNA(microRNA或miRNA)是指长度约21～25nt某些特殊的小型非编码RNA组成的家族,这些miRNA能够识别特定的目标mRNA,并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和/或抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的作用,并与个体发育、干细胞分化和疾病发生密切相关。由于肿瘤本质上是一种多基因异常疾病,通过激活一种/多种原癌基因的表达及抑癌基因的突变缺失从而使肿瘤细胞逃避了正常生长调控机制,自主进行增殖和侵袭、出现恶性表型。因此miRNA在包括胶质瘤在内的所有恶性肿瘤的发病机制、早期诊断以及寻找新的治疗策略的研究中意义重大。目的1.构建目的基因的RNA干扰慢病毒质粒载体。2.构建融合蛋白过表达质粒载体。3.目的基因的RNA有效干扰靶点的筛选。方法1.针对目的基因靶基因序列,利用公用网站按照RNA干扰序列设计原则,设计4个RNA干扰靶点序列,选择最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程;将合成含干扰序列的双链DNA oligo直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR鉴定,在进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。2.从cDNA文库中,利用PCR方法提取目的基因,将目的基因与目的载体分别进行双酶切。纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转化入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR鉴定,其上下游引物分别设计在载体和目的基因上,PCR鉴定为阳性的克隆,证明目的基因已经定向连入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确的即为构建成功的融合蛋白过表达质粒载体。3.构建好含有目的基因的过表达克隆质粒和针对靶基因不同干扰靶点的RNA干扰病毒载体质粒,根据Invitrogen公司的lipofectamine 2000使用说明共转染培养好的工具细胞(即293T细胞),转染24h后荧光显微镜下观测转染效果。转染36~48h后收集细胞抽提蛋白,采用Western blot检测目的蛋白的表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果。结果1.目的基因RNA干扰慢病毒载体的制备电泳结果显示:对比单链的位置,双链处有条带,说明双链DNA oligo合成成功。Age I和EcoRI酶切线性化后的载体质粒经过琼脂糖凝胶电泳检测表明未酶切载体质粒在5kb左右有明显条带,酶切后的质粒在8kb左右有明显条带,结果说明其已经达到线性化要求。连接入vshRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为:340bp;没有连接入vshRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为:306 bp。阳性克隆均在340bp左右有条带。2.目的基因过表达载体的构建琼脂糖凝胶电泳验证目的片段大小约为:130bp。使用Mfe I/ Hpa I进行酶切消化后进行琼脂糖凝胶电泳验证,显示在130bp左右有条带。克隆的PCR的鉴定显示阳性克隆PCR产物大小约为467bp,自连约为365bp。最后用阳性克隆进行测序,测序结果显示目的片段正确克隆入载体中。3.目的基因RNAi有效靶点的筛选转染后免疫荧光检测显示表达质粒和干扰质粒成功转染入293T细胞,估测其转染率大于70%。Western blot检测显示在两个质粒浓度下PscSI576的敲减效果最好,因而是最佳靶点。结论1.成功构建了人miR-221基因的RNA干扰慢病毒载体。2.成功构建了人miR-221基因的RNA的融合蛋白过表达载体。3.成功筛选出人miR-221基因的RNA干扰的有效靶序列。