酵母胞质中产生的PrP<'Sc>-like构象自我传播能力的研究

• 作 者: 杨文斌
• 机 构: 中国科学院微生物研究所
• 出 处: 中国科学院微生物研究所
• 发表日期: 2006年期
• 关键词: 朊病毒 构象转变 细胞质 蛋白质折叠 酵母细胞质

朊蛋白(PrP)在体内合成过程中，如果发生了错误折叠，将会逆转位(retro—translocation)至细胞质中，交给蛋白酶体(proteasome)降解。当蛋白酶体活性下降或受到破坏时，就会产生胞质型PrP(cytosolic PrP，cyPrP)。cyPrP具有蛋白酶抗性和聚集状构象，因此，在细胞质的环境中产生的cyPrP是具有PrPSc-like构象的蛋白。为了探究PrPc-PrPSc构象转化的分子机制，阐明PrPSc致病机理，研究了cyPrP的超微结构及其构象自我传递的能力。本研究利用酵母细胞质环境，在异源系统中表达了鼠PrP(mouse PrP，mPrP)，得到了cyPrP。本研究中采用的质粒p2μ GPD—mPrP(23—230)编码mPrP的成熟蛋白23—230aa，即除去了两端的信号肽。为防止异源表达的蛋白在酿酒酵母中降解，在mPrP的两端各加了一个丝氨酸。同时，2μ质粒上的GPD启动子对表达外源蛋白具有强启动能力。选用了W303(pep4-)作为表达菌株，W303(pep4-)是敲除pep4基因的改良菌株，丧失了大部分内源蛋白酶的活性，可以使外源蛋白稳定表达。　　
酵母细胞质中产生的cyPrP主要是以聚集状构象为主，几乎所有的cyPrP部在沉淀组分中。cyPrP经蛋白酶K(proteinase K，PK)消化，在16—20kDa.左右出现了抗性条带；表明cyPrP具有一定的PK抗性。说明cyPrP具有有序的空间结构堆积。电子显微镜观察纯化后的cyPrP，发现cyPrP呈现纤维杆状结构，直径约20 nm，这与prpSc的超微结构相似。在酵母细胞质中产生的cyPrP呈现纤维杆状结构，其最长的长度可达800nm，同时，部分cyPrP却呈现短的纤维杆状结构。同时，也发现大部分的cyPrP呈现不定形的小珠状结构，其直径约为20nm。Prion最重要的性质之一是能够自我传播构象。体外转化实验已表明PrPSc具有这种能力。利用PrPres(PrP resistant to PK)体外扩增技术研究了cyPrP的体外构象传递能力。在PrPres构象体外扩增系统中，cyPrP能够使正常小鼠脑悬液中PK敏感的PrPc，转变成PrPres。同时，用不转质粒的酿酒酵母菌W303(pep4-)作为阴性对照，发现其不能使正常小鼠脑悬液中PK敏感的PrPc，转变成PrPres。　　
实验结果表明，在酵母细胞质中产生的prpSc-like构象具有体外自我传播的能力，cyPrP可能是导致朊病毒疾病的神经毒性分子之一。cyPrP的体内感染性实验也正在进行。cyPrP为研究散发型和遗传型朊病毒疾病的致病机理提供了新的思路。