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前言 肿瘤发生发展与许多基因的遗传(genetic)和表观遗传(epigenefic)改变有关，其中杂合性丢失、甲基化引起的基因沉默、遗传印迹异常、基因扩增、信号传导分子和调节子异常等，皆可引起相应基因及其下游作用分子的表达改变，实际上基因表达异常是引起高等生物病理状态的根本原因，所以通过比较正常细胞与不同阶段肿瘤细胞的基因表达谱，揭示差异表达基因，是鉴定肿瘤相关基因的重要手段，也是从整体水平阐明癌症发生发展机制的重要途径。多年来本室一直着重从分子生物学角度研究胃癌发生发展不同阶段，特别是癌前病变阶段，基因表达变化的规律及其内在机制，试图揭示胃癌病因，为肿瘤治疗和诊断提供靶标。本实验构建胃异型增生组织cDNA消减文库，筛查癌前病变相关基因，并应用基因芯片技术动态、整体地研究这些基因在胃癌发生发展不同阶段的表达，探讨胃癌发病机制。此外，对其中筛选的两个基因ACE2和SDFR1与胃癌的关系进行了深入研究。 实验材料和方法 1．显微切割-cDNA PCR-SSH 手工显微切割取胃异型增生和正常组织，然后借鉴cDNA-RDA方法对获取的少量组织提取的cDNA经MboⅠ酶切后连上接头，以接头序列为特异性引物，通过接头介导的PCR方法进行cDNA的全转录组扩增；再以扩增产物做tester和driver进行双向抑制性消减杂交，将显微切割、RDA和SSH的优点结合，创建了显微切割-cDNA PCR-SSH法。消减后片段与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索，如果为新序列，送交GenBank登录。 2．斑点杂交法 筛选的阳性克隆应用96 well dot-blot system制备杂交膜，斑点杂交法检测这些克隆在胃癌发生发展不同阶段的表达，包括异型增生1例、早期胃癌1例和进展期胃癌4例。与配对正常组织比较，筛选差异表达基因。 3.基因芯片技术 本室自行设计胃癌相关基因芯片，其中包括作者筛选的26个阳性克隆。应用基因芯片技术动态、整体地研究这些克隆在2例胃癌标本发生发展不同阶段的表达，包括癌前病变，癌原发灶和淋巴结转移癌。根据胃癌进程，将相邻阶段分别设计为实验组和对照组，筛选差异表达基因。 4.半定量RT一PCR 检测ACEZ和SDFRI基因在30例胃癌组织和配对正常组织中表达，及在胃癌细胞系MKNI、BGC823，肝癌细胞系BEL一7402中表达，p一aetin做内对照，利用Primer 3 .0软件设计引物。 5.mRNA原位杂交法 以筛选的克隆片段做探针，检测ACEZ和SDFRI基因在胃癌发生发展不同阶段石蜡切片标本中表达，包括正常胃粘膜、异型增生、早期胃癌、进展期胃癌各3例，及胃癌细胞系MKNI、BGc823，肝癌细胞系BEL一7402。实验结果 (一)第一部分 1.正常和异型增生组织互为tester和driver成功构建了两个。DNA消减文库，分别包含在异型增生组织中表达上调和表达下调基因。测序的26个阳性克隆中，巧个与已知基因高度同源，根据功能可分为六类:(1)功能未知基因3个:月日20816(h月冲thetieal protein)，F曰22055(hyPOthetiealnro-tein)，FUI以17(hypothetie沮protein);(2)物质能量代谢酶类相关基因5个:NM--0 04190.1(笋trie lipase，llPF)，u9339·1(Na‘/咖eose cotl妞ns卯rter，SGLTI)，A邪82013(eytoe肠me Co石dase sub画tl)，NM一21804(angioten-sin 1 eonve正ng enZymeZ，ACEZ)，XM一58493(51耐ar to pepsin A preeursor);(3)与物质运输有关基因2个:NM一04859·l(Clath五n，heaV’y州y拌ptide(Hc)，Cl了TC)，NMes卯7190(See 23一interaeting protein，p125);(4)与细胞骨架运动有关基因1个:580562(acidic cdponin);(5)与细胞间相互作用有关基因2个:XMee008731(meprinA，beta)，NM一17455(stromal eell derivedfaetor reeeptorl，SDFRI);(6)与免疫功能有关基因2个:A只刃0521(ehromo-some6夕1 .3，HLA Class 1 region)，XM_以4902(di且池rentially expressed inhematopoietic line鳍es，GWI 12)。筛选出11个EST片段，其中3个与已知EST同源，8个为新登录的EST，GenBank登录号为BQ164614一BQ164616，BQ291516一BQ291520。 2.斑点杂交结果显示:26个克隆中20个克隆在胃癌中有表达改变，其中5个克隆在异型增生、早期胃癌、进展期胃癌中皆有表达改变。5个克隆中4个克隆为已知基因:v125，e外oehrome。。石dase subunitl，mephnA，aeid-ie ealponin，另一个是EST(BQ291519);3个克隆表达上调(p125，eytoehromeCo石dase subunitl，meprinA)，2个克隆表达下调(aeidie ealponin，BQ291519)，可能是重要的胃癌癌前病变相关基因。 (二)第二部分 1.基因芯片结果显示:26个克隆中23个克隆在胃癌中有表达改变，癌前病变、癌和淋巴结转移癌中差异表达基因的数目分别为6，巧，18:表达上调和表达下调基因数目分别为3，3;2，13;0，18。 2.根据在胃癌发生发展不同阶段中的作用，23个基因可分为五类:(1)与癌前病变有关基因6个:p125，GWI 12，meprinA，SDFR一，aeidiee已ponin，BQ291519;(2)胃癌阶段特有的差异表达基因4个，与胃癌发展